張富娟，陳鐵軍，于麗萍

(本溪市中心醫(yī)院，遼寧 本溪 117000)

非小細(xì)胞肺癌約占肺癌總數(shù)的80%，具有發(fā)病率高、預(yù)后差的特點[1].手術(shù)、放化療是目前臨床治療非小細(xì)胞肺癌的主要手段，因多數(shù)患者確診時已發(fā)展至中晚期，失去了手術(shù)機會，僅能接受放化療治療，但傳統(tǒng)化療的5 a生存率低于20%[2].近年來，隨著生物靶向治療技術(shù)的快速發(fā)展，為中晚期非小細(xì)胞肺癌患者帶來新的希望[3].厄洛替尼作為表皮生長因子受體(Epidermal growth factor receptor，EGFR)酪氨酸激酶抑制劑(Tyrosine kinase inhibitors，TKI)的代表藥物，可有效提高非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后水平[4].臨床觀察發(fā)現(xiàn)，厄洛替尼一線治療無進(jìn)展生存期(PFS)明顯優(yōu)于化療[5].但治療1 a后多數(shù)患者會出現(xiàn)厄洛替尼耐藥，是肺癌患者死亡的主要原因[6]，因此，探討厄洛替尼耐藥機制具有重要意義.

miR-21位于17q23染色體上，是潛在的非小細(xì)胞癌分子標(biāo)志物，對腫瘤細(xì)胞具有促生長和抗凋亡作用[7].有研究[8-10]發(fā)現(xiàn)：在多種耐藥腫瘤細(xì)胞中存在miR-21表達(dá)上調(diào)，包括miR-21過表達(dá)可誘發(fā)胃癌細(xì)胞對阿帕替尼的耐藥，介導(dǎo)胰腺癌對吉西他濱的耐藥，介導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞對阿霉素的耐藥.而miR-21與非小細(xì)胞肺癌厄洛替尼耐藥的關(guān)系有待研究證實.本研究選用了EGFR敏感型肺癌細(xì)胞株P(guān)C-9，在體外誘導(dǎo)出厄洛替尼獲得性耐藥株細(xì)胞模型PC-9/ER，并通過轉(zhuǎn)染siRNA下調(diào)miR-21的表達(dá)，旨在探討miR-21在非小細(xì)胞肺癌厄洛替尼獲得性耐藥中的作用.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人肺腺癌PC-9細(xì)胞(南京科佰生物科技有限公司)；使用1～5 μmol/L的厄洛替尼誘導(dǎo)PC-9細(xì)胞8個月，再以0.1 μmol/L的厄洛替尼連續(xù)培養(yǎng)得到獲得性耐藥細(xì)胞株P(guān)C-9/ER.胎牛血清、DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基(蘇州艾萊薩生物科技有限公司)；CCK-8、Trizol試劑(上?？道噬锟萍加邢薰?；鼠抗人miR-21單克隆抗體、鼠抗人GAPDH單克隆抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(上海默悉生物科技有限公司)；miR-21單基因套裝siRNA(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司).

1.2 方 法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及CCK-8檢測

1.2.2 實時定量PCR檢測

應(yīng)用Trizol法提取各細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA.miR-21、GAPDH引物序列由南京金斯瑞生物科技有限公司設(shè)計合成.miR-21上游5′-ATGG GTGCTCG TACTGCTG-3′，下游5′-ACTCGATCGG AAACTCTGACAG-3′；內(nèi)參GAPDH上游5′-TTCC GCTCCGAGACACGAGCG-3′，下游5′-GGCGGTCGA GTGGTACCTACTAC-3′.反應(yīng)條件：95 ℃ 40 s，95 ℃ 10 s，56 ℃ 30 s，共40個循環(huán)，延伸72 ℃ 30 s.擴增產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳，計算miR-21的相對表達(dá)量.

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及對PC-9/ER耐藥性的影響

取PC-9/ER細(xì)胞，使用陽離子脂質(zhì)體法進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，分為陰性對照組、siRNA-1組、siRNA-2組、siRNA-3組.轉(zhuǎn)染前按6×105個/孔的密度將細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)至貼壁生長后，按siRNA說明書操作.使用riboFECTCP轉(zhuǎn)染試劑稀釋各組儲存液，加入FECTTM CP轉(zhuǎn)染試劑，室溫下靜置20 min，加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，常規(guī)培養(yǎng)24 h，通過實時定量PCR檢測各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞miR-21表達(dá)量.選取表達(dá)量最低組的siRNA為基因敲減工具，使用終濃度10-2、10-1、100、101、102的厄洛替尼處理PC-9/ER細(xì)胞48 h后，應(yīng)用CCK-8檢測細(xì)胞生存分?jǐn)?shù).

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度厄洛替尼處理后PC-9與PC-9/EP的生存分?jǐn)?shù)

隨著厄洛替尼終濃度的增加，PC-9細(xì)胞和PC-9/ER細(xì)胞的生存分?jǐn)?shù)均出現(xiàn)不同程度的下降，其中，厄洛替尼終濃度10-2、10-1、100、101、102的PC-9/ER細(xì)胞生存分?jǐn)?shù)明顯高于PC-9細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01).計算得到PC-9/ER細(xì)胞的IC50值為(7.74±1.49)μmol/L，明顯高于PC-9細(xì)胞的(0.11±0.03)μmol/L，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=21.493，P=0.001)；PC-9/ER細(xì)胞的耐藥指數(shù)為69.93±18.40，說明厄洛替尼耐藥細(xì)胞株P(guān)C-9/ER構(gòu)建成功，能夠用于后續(xù)實驗.見表1.

2.2 miR-21在PC-9與PC-9/EP細(xì)胞中的表達(dá)水平

由于厄洛替尼對PC-9細(xì)胞的IC50均值為0.11 μmol/L，因此，本研究選用質(zhì)量濃度為0.1 μmol/L的厄洛替尼處理PC-9、PC-9/ER細(xì)胞48 h，檢測miR-21表達(dá)量，結(jié)果顯示：PC-9/ER細(xì)胞的miR-21表達(dá)量明顯高于PC-9細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01).為進(jìn)一步分析miR-21表達(dá)與厄洛替尼劑量的關(guān)系，本研究用0.1、0.2、0.3 μmol/L的厄洛替尼處理PC-9、PC-9/ER細(xì)胞，結(jié)果顯示：隨著厄洛替尼濃度的增加，PC-9/ER細(xì)胞的miR-21表達(dá)量顯著提高，而PC-9細(xì)胞的miR-21表達(dá)無明顯變化.見表2.

2.3 不同敲減工具對PC-9/ER細(xì)胞中miR-21表達(dá)的影響

為篩選下調(diào)PC-9/ER細(xì)胞中miR-21表達(dá)的基因敲減工具，轉(zhuǎn)染24 h后通過實時定量PCR檢測各轉(zhuǎn)染組PC-9/ER細(xì)胞miR-21的表達(dá)量，結(jié)果顯示：與陰性對照組比較，siRNA-1組、siRNA-2組、siRNA-3組的miR-21表達(dá)量明顯下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；其中siRNA-1組miR-21表達(dá)量明顯低于siRNA-2組、siRNA-3組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05).因此，選用siRNA-1基因敲減工具用于后續(xù)實驗.見表3.

2.4 下調(diào)miR-21表達(dá)對PC-9/ER細(xì)胞厄洛替尼耐藥性的影響

使用終濃度10-2、10-1、100、101、102的厄洛替尼處理PC-9/ER細(xì)胞48 h后，siRNA-1組PC-9/ER細(xì)胞的細(xì)胞生存分?jǐn)?shù)明顯低于陰性對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01).見表4.

表1 不同濃度厄洛替尼處理后PC-9與PC-9/ER細(xì)胞的生存分?jǐn)?shù)Tab.1 Survival scores of PC-9 and PC-9/ER cells treated with erlotinib at different concentrations

表2 miR-21在PC-9與PC-9/ER細(xì)胞中的表達(dá)水平Tab.2 miR-21 expression levels in PC-9 and PC-9/ER cells

表3 各組PC-9/ER細(xì)胞中miR-21表達(dá)量Tab.3 miR-21 expression in PC-9/ER cells of each group

表4 兩組PC-9/ER細(xì)胞的生存分?jǐn)?shù)Tab.4 PC-9/ER cell survival scores of the two groups

3 討 論

miR-21作為一種致癌miRNA在肺癌、胰腺癌、直腸癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用[11-12].相關(guān)研究[13]顯示：miR-21在癌組織中表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，且高表達(dá)提高了非小細(xì)胞肺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的風(fēng)險，不良預(yù)后發(fā)生率高.近年來研究[14-15]發(fā)現(xiàn)：EGFR-TKI靶向治療肺癌耐藥性的出現(xiàn)與miRNA異常表達(dá)有關(guān)，使用EGFR-TKI能夠抑制miR-21的表達(dá)，提示miR-21可能調(diào)控EGFR信號通路.因此，推測致癌基因miR-21可能參與了EGFR-TKI藥物代謝及耐藥性的發(fā)生.厄洛替尼是一種低分子EGFR-TKI，為晚期或轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌患者帶來了新希望，并逐漸得到臨床認(rèn)可.EGFR-TKI初治患者在治療起始多數(shù)能有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，緩解病情，但隨著治療時間的延長，發(fā)展為獲得性耐藥的比例很高，是肺癌患者死亡的主要原因之一.有研究[16]對EGFR-TKI的耐藥機制進(jìn)行了探討，獲得了MCT酶抑制劑、EMT抑制劑等多種活性成分，但研究多停留在動物實驗和體外細(xì)胞實驗層次，并未應(yīng)用于臨床治療.本研究在已有研究報道的基礎(chǔ)上，探討非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對厄洛替尼的耐藥機制，旨在為研發(fā)逆轉(zhuǎn)厄洛替尼耐藥的靶向治療方案提供理論依據(jù).

本研究選用了EGFR敏感型肺癌細(xì)胞株P(guān)C-9，并在體外誘導(dǎo)出了厄洛替尼獲得性耐藥株細(xì)胞模型PC-9/ER，通過實時定量PCR檢測顯示，PC-9/ER細(xì)胞miR-21表達(dá)水平較PC-9細(xì)胞明顯提高.為進(jìn)一步證實miR-21在PC-9細(xì)胞厄洛替尼獲得性耐藥中的作用，本研究通過siRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)下調(diào)了miR-21在PC-9/ER細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果顯示：miR-21表達(dá)下調(diào)明顯改善了PC-9/ER細(xì)胞對厄洛替尼的耐藥性.相關(guān)研究[17-18]顯示：非小細(xì)胞癌細(xì)胞中過表達(dá)miR-21可明顯激活A(yù)kt信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，而出現(xiàn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的非小細(xì)胞肺癌被認(rèn)為是厄洛替尼獲得性耐藥的主要原因之一.亦有研究[19]顯示：miR-21在卵巢癌中通過活化PI3K-Akt信號通路介導(dǎo)對鉑類化療藥物的耐藥.在下一步的研究中，將通過基因芯片技術(shù)比較PC-9細(xì)胞與PC-9/ER細(xì)胞的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)信號蛋白的表達(dá)差異，進(jìn)一步探討厄洛替尼獲得性耐藥的分子機制.