馬春華 陳文文 邢 越

（武夷學院茶與食品學院，福建武夷山 354300）

氟喹諾酮類藥是一類化學合成抗菌藥，對于多種革蘭陰性菌具有明顯的殺菌效果。氟喹諾酮類藥物是喹諾酮藥物發(fā)展到第3 代的產(chǎn)物，對組織細胞的穿透力加強，因而吸收好，抗菌譜和殺菌效果強，作用范圍廣，在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中應用廣泛。氟喹諾酮類藥主要包括恩諾沙星及其代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星，恩諾沙星在動物體內(nèi)代謝生成環(huán)丙沙星，在家禽體內(nèi)殘留形式以環(huán)丙沙星為主。隨著氟喹諾酮類藥物的廣泛使用，細菌耐藥和不良反應也相繼發(fā)生。通過有效的分析技術，對動物性食品中的氟喹諾酮類藥物殘留進行檢測，對于指導養(yǎng)殖業(yè)正確用藥，確保動物性食品安全具有十分重要的意義。

藥物殘留的檢測技術日益先進，常用的有高效液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS）、液相色譜-四級桿-飛行時間質(zhì)譜法及免疫法等。HPLC-MS 具有較高的靈敏度，但是由于儀器本身較昂貴，檢測成本高，適合科研院所；而高效液相色譜儀建立的分析方法在實際工作中有較好的應用性與推廣性。食品樣品組成復雜，檢測前需要采用合適的樣品前處理方法，減少其他組分的干擾及基質(zhì)的影響。目前，檢測抗生素常用的前處理方法有液液萃取（LLE），基質(zhì)固相分散（MSPD）、QuEChERS、結合固相萃取等方法。

國家標準規(guī)定恩諾沙星與環(huán)丙沙星之和，在禽肉和其他動物肌肉中的最大殘留限量為100 μg/kg。本研究建立了一種QuEChERS-高效液相色譜快速測定雞肉中恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星3 種喹諾酮類獸藥殘留的分析方法。

1 材料與方法

1.1 儀器、藥品與試劑

Agilent 1260 高效液相色譜儀，美國Agilent 有限公司；DN-12A 水浴氮吹儀，上海比朗儀器制造有限公司；TGL-20M臺式高速冷凍離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；渦旋混勻器，德國IKA 公司。依諾沙星（ENO）、諾氟沙星（NOR）、環(huán)丙沙星（CIP） 標準品，純度＞99.0，北京百靈威科技有限公司。

N-丙基乙二胺吸附劑（PSA）、十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18） 購自天津博納艾爾杰公司。

標準貯備溶液：準確稱取一定量的標準品，用甲醇溶解配成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL 的溶液，4 ℃下避光保存。將各標準儲備液用0.2%甲酸水溶液稀釋，配成混合標準溶液。

1.2 樣品前處理與凈化

將雞肉絞碎，稱取2.0 g 置于50 mL 聚丙烯離心管中，加入2 mL 水，渦旋混勻后加入8 mL5%甲酸-乙腈溶液，渦旋30 s，再加入4 g 無水硫酸鎂、1 g氯化鈉，渦旋1 min 后，4 ℃的條件下8 000 r/min離心3 min，上清液全部轉(zhuǎn)移至凈化管，管中有50 mg PSA、150 mg C18，渦旋1 min，5 000 r/min 離心5 min。將上清液轉(zhuǎn)移到10 mL 聚丙烯離心管中，45 ℃水浴氮吹儀吹干，用1 mL 10%乙腈水溶液（2%甲酸） 復溶，用一次性無菌注射器吸取，過孔徑0.45 μm 有機相濾膜，上機測定。

1.3 色譜條件

洗脫程序：0 min～3 min，85% A+15% B；3 min～6 min，75% A+25 % B ；6 min～7 min，67.5%A+32.5%B；7 min～8 min，60%A+40%B；8 min～13 min，85%A+15%B。

2 結果與討論

2.1 分析條件的選擇與優(yōu)化

運用色譜柱分離氟喹諾酮抗生素時，采用酸性流動相有比較好的分離效果。在利用HPLC 分析氟喹諾酮類抗生素殘留時，以乙腈為流動相常出現(xiàn)色譜峰拖尾等現(xiàn)象，當以乙腈-甲酸溶液為流動相，沒有雜峰出現(xiàn)，分離效果較好。本研究采用乙腈和甲酸水溶液作為流動相，對比不同甲酸含量0.1%、0.2%和0.4%的分離效果，結果表明甲酸為0.2%時的出峰時間適中，峰形較好，峰面積最大，故選用0.2%甲酸水溶液（A 相） -乙腈（B 相） 作為流動相。

2.2 提取條件的優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的優(yōu)化

GB/T 20366—2066《動物源產(chǎn)品中喹諾酮類殘留量的測定》中樣品采用甲酸-乙腈提取，提取液用正己烷凈化，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)近干，氮氣流吹干。

選擇合適的提取劑很重要，對比乙腈、2%甲酸乙腈、5%甲酸乙腈和EDTA-McIlvaine 的提取效果，比較同一濃度下已知樣品中氟喹諾酮類抗生素的回收率，可以得出5%甲酸乙腈作為提取溶液時測定結果的回收率最好，2%甲酸乙腈次之，EDTAMcIlvaine 回收率最低，結果如下頁圖1 所示。

2.2.2 凈化條件

查閱文獻可知，QuEChERS 方法常用的脫水劑主要是無水硫酸鎂、無水硫酸鈉、檸檬酸鈉、氯化鈉等，常用吸附劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18）、N-丙基乙二胺（PSA）。經(jīng)前期試驗確定凈化條件為：無水硫酸鎂4.0 g、氯化鈉1.0 g、C18用量150 mg、PSA 50 mg。

圖1 不同溶劑萃取效果比較

2.3 方法驗證

2.3.1 線性范圍、檢出限與定量限

按照1.2 處理得到質(zhì)量濃度分別為1 μg/kg、2 μg/kg、5 μg/kg、10 μg/kg、20 μg/kg、40 μg/kg、80 μg/kg、100 μg/kg 的基質(zhì)加標工作溶液，繪制各化合物的標準曲線，結果表明3 種喹諾酮類獸藥濃度在1 μg/kg～100 μg/kg 線性關系良好，R2均大于0.99（表1）。在空白雞肉樣品中分別添加0.1 μg/kg、0.3 μg/kg、0.5 μg/kg、1.0 μg/kg、4.0 μg/kg 的3 種氟喹諾酮混合標準溶液（n=5），經(jīng)樣品前處理后檢測，以各化合物響應值大于3 倍信噪比（S/N） 時對應的加標水平為方法檢出限（LOD），10 倍信噪比為定量限，本方法檢出限為0.3 μg/kg，方法定量限為1.0 μg/kg。

羅靜等采用基質(zhì)固相分散－液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法檢測雞蛋中氟喹諾酮類藥物殘留，檢出限0.1 μg/kg；夏駿等采用QuEChERS-HPLC-MS 法測動物源性食品中氟喹諾酮類藥物殘留量，檢出限2.0 ng/g～3.0 ng/g。本研究采用QuEChERS 技術對樣品進行處理，分散固相萃取對樣品凈化，液相色譜進行檢測，可以達到比較低的檢測限，節(jié)省時間，對檢測設備要求不高，可以滿足日常檢測的需要。

2.3.3 方法的精密度與準確度

稱取2 g 絞碎混勻的雞肉，然后向其添加2 種不同質(zhì)量濃度的混合標準溶液（添加質(zhì)量濃度為5.0 μg/mL、20.0 μg/mL），按本研究方法進行測定，計算出平均回收率為83.3%～112.0%，相對標準偏差（RSD） 為3.2%～6.7%，結果如表2 所示。

表1 線性方程和相關系數(shù)

表2 氟喹諾酮類藥物的回收率和相對標準偏差

2.3.4 實際樣品測定

采用本方法對市場上10 個樣品進行分析，結果有2 個雞肉樣品檢測出環(huán)丙沙星，檢測結果分別為5.7 μg/kg、11.6 μg/kg，市場上雞肉喹諾酮類藥物殘留未超出限量標準。

3 結論

本文建立了QuEChERS 方法結合高效液相色譜法檢測雞肉中環(huán)丙沙星、諾氟沙星、依諾沙星殘留的方法。采用QuEChERS 凈化技術，操作簡便,縮短樣品處理時間，提高檢測效率。該方法測定3種氟喹諾酮類藥物的最低定量限為1.0 μg/kg，能夠更好地滿足國家規(guī)定的要求，可用于日常檢測。