日本黃姑魚(yú)魚(yú)皮免疫活性肽的酶解制備工藝研究

董曉澤，徐書(shū)敏，王麗君，趙 越，王世光，唐云平，余方苗，丁國(guó)芳

（浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江省海洋生物醫(yī)用制品工程技術(shù)研究中心，浙江舟山 316022）

免疫系統(tǒng)是人體的重要系統(tǒng)之一，它能有效的防止病菌入侵，維持機(jī)體健康[1-2]。免疫系統(tǒng)功能低下會(huì)降低人對(duì)疾病的抵抗能力，造成容易感染、生病等。巨噬細(xì)胞是研究免疫調(diào)節(jié)常用的細(xì)胞種類(lèi)之一，它在免疫系統(tǒng)中扮演十分重要的角色，它可以激活其它免疫細(xì)胞，并且有噬菌作用。因此，研究藥物對(duì)巨噬細(xì)胞增殖的影響十分重要。

生物活性肽（bioactive Peptides，BAP）是指對(duì)機(jī)體具有積極效果的肽類(lèi)化合物。研究顯示，生物活性肽具有降低血壓血脂、抗菌以及免疫調(diào)節(jié)等作用[3-4]。目前廣泛應(yīng)用的生物活性肽的制備方法主要有三種：化學(xué)溶劑萃取、微生物工程發(fā)酵和酶促水解。用內(nèi)肽酶和外肽酶水解生物蛋白來(lái)獲得生物活性肽的方法被稱(chēng)為酶水解法[5-6]，酶水解提取法反應(yīng)條件溫和、安全無(wú)毒，因此成為食品及醫(yī)藥品行業(yè)的首選方法。不同的蛋白酶酶解同種蛋白的酶解產(chǎn)物的功能性質(zhì)不同，蛋白酶的選擇是采用酶解法制備生物活性肽的關(guān)鍵[7-9]。葉盛旺等[10]從青蛤中酶解提取的青蛤多肽具有激活巨噬細(xì)胞增強(qiáng)機(jī)體免疫力的作用；劉倩茹等[11]通過(guò)酶解法從北太平洋魷魚(yú)纏卵腺中提取了具有抗氧化活性的寡肽。宋茹等[12]利用中性蛋白酶從魷魚(yú)中提取了魷魚(yú)蛋白抗氧化肽。由此可見(jiàn)，酶水解法在提取生物活性肽領(lǐng)域中應(yīng)用廣泛。

日本黃姑魚(yú)Nibea japonica 俗稱(chēng)黑毛鲿，主要分布于我國(guó)的東南部海和日本海南部區(qū)域[13-14]。目前的報(bào)道中對(duì)日本黃姑魚(yú)的研究多集中于養(yǎng)殖與運(yùn)輸方面，關(guān)于日本黃姑魚(yú)魚(yú)皮免疫活性肽的研究報(bào)道較少，柴學(xué)軍等[15]研究了鹽度和溫度對(duì)日本黃姑魚(yú)胚胎發(fā)育的影響；孫敏等[16]研究了在發(fā)育早期的日本黃姑魚(yú)體內(nèi)消化酶的活性；孫鵬等[17]研究了運(yùn)輸脅迫對(duì)日本黃姑魚(yú)肝臟抗氧化能力的影響。然而，在食品加工過(guò)程中（如制作魚(yú)丸） 會(huì)產(chǎn)生許多副產(chǎn)品，如魚(yú)皮、魚(yú)骨等，這些物料可用作免疫活性肽的提取原料。YU Fangmiao，et al[18]研究了日本黃姑魚(yú)魚(yú)皮膠原蛋白的提取方法與溶解性；TANG Yunping，et al[19]研究了日本黃姑魚(yú)魚(yú)皮膠原蛋白在化妝品中應(yīng)用的可能性。因此，本實(shí)驗(yàn)采用酶促水解法，以小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7 的相對(duì)增殖率為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行最優(yōu)酶種篩選，再經(jīng)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面分析法確定日本黃姑魚(yú)魚(yú)皮酶解工藝，以期為制備日本黃姑魚(yú)魚(yú)皮膠原蛋白肽和進(jìn)一步研究其免疫活性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與設(shè)備

日本黃姑魚(yú)：由浙江省海洋水產(chǎn)研究所提供。蛋白酶：北京亞太恒信生物科技有限公司。Dulbecco’s Modified Eagle Medium （DMEM）高糖培養(yǎng)基：Gibco 公司。3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）、二甲亞砜（DMSO）：Sigma 公司。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW 264.7：于中科院上海細(xì)胞所購(gòu)買(mǎi)，由本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)。

超純水儀：美國(guó)Millipore 公司；高速低溫離心機(jī)：日本日立公司；冷凍干燥機(jī)：德國(guó)CHRIST 公司；超凈工作臺(tái)：上海智誠(chéng)分析儀器制造公司；CO2培養(yǎng)箱：美國(guó)Thermo 公司；倒置顯微鏡：日本OLYMPUS 公司；酶標(biāo)儀：美國(guó)Bio-Rad 公司等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 日本黃姑魚(yú)魚(yú)皮免疫調(diào)節(jié)肽制備流程

日本黃姑魚(yú)→取魚(yú)皮→異丙醇脫脂→NaOH 去除雜蛋白→酶解→冷凍干燥→日本黃姑魚(yú)魚(yú)皮免疫調(diào)節(jié)肽。

1.2.2 日本黃姑魚(yú)魚(yú)皮預(yù)處理

將500 g 魚(yú)皮用自來(lái)水清洗干凈，剪成1 cm×2 cm 大小，異丙醇5 000 mL 脫脂24 h，用純水將魚(yú)皮洗至無(wú)異丙醇味；0.1 mol·L-1NaOH 溶液5 000 mL 去除雜蛋白24 h，用純水洗至中性，將魚(yú)皮放置于-20 ℃冰箱冷凍備用。

1.2.3 最優(yōu)酶種的選擇

稱(chēng)量5 g 日本黃姑魚(yú)魚(yú)皮，按最適pH 和溫度[20]分別將胃蛋白酶（pH 2.0，37 ℃）、木瓜蛋白酶（pH 6.0，60 ℃）、中性蛋白酶（pH 7.0，45℃）、胰蛋白酶（pH 8.0，37 ℃）、堿性蛋白酶（pH 10.0，45 ℃） 5 種蛋白酶進(jìn)行酶解反應(yīng)。所用蛋白酶的量均為1 500 U·g-1、液料比（純水與魚(yú)皮的比例）10：1（mL·g-1），時(shí)間為6 h。采用MTT 比色法[21]檢測(cè)各酶制備的產(chǎn)物對(duì)巨噬細(xì)胞RAW 264.7 增殖的影響，按照式（1）計(jì)算巨噬細(xì)胞RAW 264.7 相對(duì)增殖率，并以其為指標(biāo)，篩選最優(yōu)酶種。

實(shí)驗(yàn)組OD490為給藥后的細(xì)胞上清液吸光度；空白對(duì)照組OD490為相同時(shí)間未給藥的細(xì)胞上清液吸光度。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

稱(chēng)量5 g 日本黃姑魚(yú)魚(yú)皮，使用1.2.3 中最優(yōu)酶種，選取pH、溫度、時(shí)間、加酶量、液料比5 個(gè)影響酶解過(guò)程的主要因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，單因素水平表見(jiàn)表1。以巨噬細(xì)胞RAW 264.7 相對(duì)增殖率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察各因素對(duì)酶解產(chǎn)物活性的影響。

表1 單因素水平表Tab.1 Factor and levels

1.2.5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

在1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，用軟件Design Expert V8.0.6 建立響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，探求日本黃姑魚(yú)魚(yú)皮酶解最佳工藝。以巨噬細(xì)胞RAW 264.7 相對(duì)增殖率（Y/%）為考察指標(biāo)，酶解溫度（A），酶解時(shí)間（B）及液料比（C）為自變量，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平編碼見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平表Tab.2 Factor and Levels in response surface experiment

1.2.6 細(xì)胞培養(yǎng)

參照葉盛旺等[20]巨噬細(xì)胞RAW 264.7 的培養(yǎng)方法培養(yǎng)細(xì)胞并傳代，選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 5 種蛋白酶酶解結(jié)果

由圖1 得知，5 種商業(yè)蛋白酶中，中性蛋白酶制備的酶解產(chǎn)物作用下的RAW 264.7 細(xì)胞相對(duì)增殖率最高（41.53%）。因此選擇中性蛋白酶為最優(yōu)酶種。

2.2 中性蛋白酶酶解單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 pH 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖2 得知，在pH 5～9 之間，酶解產(chǎn)物作用下的RAW 264.7 細(xì)胞相對(duì)增殖率的變化不大，pH 為7 時(shí)達(dá)到最大值（46.84%），可能由于酶的活性會(huì)隨著pH 的改變而改變，最終導(dǎo)致酶解產(chǎn)物活性的改變。最終選定酶解pH 為7。

圖1 5 種酶解產(chǎn)物對(duì)RAW 264.7 細(xì)胞相對(duì)增殖率的影響Fig.1 Effects of five enzymatic hydrolysates on the relative proliferation rate of RAW 264.7 cells

圖2 pH 對(duì)RAW 264.7 細(xì)胞相對(duì)增殖率的影響Fig.2 Effect of pH on the relative proliferation rate of RAW 264.7 cells

2.2.2 溫度單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖3 得知，在35～45 ℃，酶解產(chǎn)物作用下的RAW 264.7 細(xì)胞相對(duì)增殖率顯著提高，45 ℃時(shí)達(dá)到最大值（44.40%），之后，隨著溫度的增長(zhǎng)，相對(duì)增殖率明顯下降。最終選定酶解溫度42.5～47.5 ℃進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。

2.2.3 時(shí)間單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖4 得知，在2～6 h 之間，酶解產(chǎn)物作用下的RAW 264.7 細(xì)胞相對(duì)增殖率顯著提高，6 h 時(shí)達(dá)到最大值（47.19%），之后，隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，相對(duì)增殖率減小。最終選定酶解時(shí)間5～7 h 進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。

圖3 溫度對(duì)RAW 264.7 細(xì)胞相對(duì)增殖率的影響Fig.3 Effect of temperature on the relative proliferation rate of RAW 264.7 cells

圖4 時(shí)間對(duì)RAW 264.7 細(xì)胞相對(duì)增殖率的影響Fig.4 Effect of time on the relative proliferation rate of RAW 264.7 cells

2.2.4 加酶量單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖5 得知，在加酶量為1 500 U·g-1時(shí)，酶解產(chǎn)物作用下的RAW 264.7 細(xì)胞相對(duì)增殖率達(dá)到最大值（53.86%），之后，隨著加酶量的增長(zhǎng)，相對(duì)增殖率減小。最終選定酶解時(shí)的加酶量為1 500 U·g-1。

2.2.5 液料比單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖6 得知，在液料比為10：1 （mL·g-1）時(shí)，酶解產(chǎn)物作用下的RAW 264.7 細(xì)胞相對(duì)增殖率達(dá)到最大值（49.38%），之后，隨著液料比的增長(zhǎng)，相對(duì)增殖率減小。最終選定液料比9：1～11：1 （mL·g-1）進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。

圖5 加酶量對(duì)RAW 264.7 細(xì)胞相對(duì)增殖率的影響Fig.5 Effect of enzyme amount on the relative proliferation rate of RAW 264.7 cells

圖6 液料比對(duì)RAW 264.7 細(xì)胞相對(duì)增殖率的影響Fig.6 Effect of liquid/solid ratio on the relative proliferation rate of RAW 264.7 cells

2.3 中性蛋白酶響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果及方差分析

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取酶解時(shí)間、溫度及液料比3 個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，設(shè)計(jì)及結(jié)果如表3 所示。

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.3 Respond surface experimental design and results

回歸模型方程：Y=14.77-9.08A+0.76B-3.39C-8.95AB-2.26AC-10.03BC+31.41A2-16.20B2+17.95C2

該模型的回歸方程的方差分析結(jié)果如表4 所示。擬合模型的F 值為16.28，對(duì)應(yīng)P＜0.01，表明所得模型較顯著。且該模型中誤差失擬項(xiàng)P＞0.05，模型失擬不顯著，表明該擬合方程與實(shí)驗(yàn)的擬合度較高，比較可靠。應(yīng)用該回歸模型能夠?qū)换ヒ蛩刂苽涞娜毡军S姑魚(yú)魚(yú)皮酶解物對(duì)RAW264.7 細(xì)胞的相對(duì)增殖率進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

表4 模型回歸方程方差分析Tab.4 ANOVA of regression equation

該模型的各交互因素的F 值被用于評(píng)價(jià)其對(duì)于實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)指標(biāo)的影響程度，更大的F 值說(shuō)明該因素對(duì)RAW264.7 細(xì)胞的相對(duì)增殖率影響越大。由表4 可知，F(xiàn)（A）=62.34，F(xiàn)（B）=0.13，F(xiàn)（C）=8.44，即各因素對(duì)相對(duì)增殖率的影響順序?yàn)闀r(shí)間＞液料比＞溫度。

2.3.2 交互作用影響結(jié)果

響應(yīng)面曲面的傾斜程度表示該因素對(duì)相對(duì)增殖率影響的強(qiáng)度；響應(yīng)曲面傾斜程度越弱，說(shuō)明其越可容忍該因素的影響[22]。等高線(xiàn)圖中曲線(xiàn)形狀表示2 個(gè)變量間的交互作用程度，越是趨近于橢圓形，交互程度越高，趨近于圓形則交互程度越低[23]。

由圖7a、b 得知，在所考察的酶解溫度和液料比范圍內(nèi)，相對(duì)增殖率有先增大后減小的趨勢(shì)，且有極大值；相對(duì)增殖率隨時(shí)間的增大而增大。另外，由等高線(xiàn)圖可知，時(shí)間等高線(xiàn)更陡峭。由此可以推測(cè)時(shí)間對(duì)相對(duì)增殖率的影響大于液料比和溫度。由圖7c 得知，在液料比和溫度等高線(xiàn)中，等高線(xiàn)沿液料比軸變化的趨勢(shì)明顯高于溫度軸，說(shuō)明液料比對(duì)相對(duì)增殖率的影響較溫度大。

圖7 響應(yīng)面和等高線(xiàn)圖Fig.7 Responsive surfaces and contour plot

2.3.3 最佳提取條件及驗(yàn)證

由Design-Expert V8.0.6 軟件分析得最佳酶解工藝是：提取時(shí)間5.52 h，溫度45.27 ℃，液料比為9.82：1（mL·g-1）?？紤]到實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中操作方便，將工藝條件修正為提取時(shí)間5.5 h，溫度45.5 ℃，液料比為10：1（mL·g-1）進(jìn)行驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)。此條件下的理論提取率為57.80%。通過(guò)3 次平行試驗(yàn)，測(cè)得最佳條件下相對(duì)增殖率為57.47%，相對(duì)誤差為0.57%，與理論提取率無(wú)顯著性差異。表明應(yīng)用響應(yīng)面法模擬的模型及最佳條件可靠。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)得到中性蛋白酶的最佳酶解條件是pH 為7，溫度45.5 ℃，時(shí)間5.5 h，加酶量1 500 U·g-1，液料比10：1 （mL·g-1），在此工藝下所得日本黃姑魚(yú)魚(yú)皮酶解產(chǎn)物刺激RAW 264.7 的相對(duì)增殖率為57.47%。該工藝為制備日本黃姑魚(yú)魚(yú)皮酶解多肽的及進(jìn)一步研究其免疫調(diào)節(jié)活性提供了依據(jù)。