酶法水解杏鮑菇谷蛋白制備抗氧化肽

趙成萍，耿正偉，張詠梅，史瑞婕，馮翠萍

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院，山西晉中 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西晉中 030801）

杏鮑菇（Pleurotus eryngii）又名刺芹側(cè)耳、刺芹菇，含有豐富的蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、碳水化合物和維生素，其中蛋白含量為12.4%～35.0%[1-3]，具有抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等功能[4-6]，是理想的功能食品。研究表明，杏鮑菇蛋白含有清蛋白、醇溶蛋白、球蛋白和谷蛋白4種蛋白，其中含量較多的為清蛋白和谷蛋白，分別占總蛋白含量的42.55%，30.71%，不同種類蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)不同、特性不同[7]。

多肽是一種由蛋白質(zhì)經(jīng)過酶分解而來的小分子物質(zhì)，具有降血壓、抗氧化、降膽固醇、降血糖等生理功能[8-14]。杏鮑菇作為一種優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)來源的食物，是多肽的重要資源，制備出的杏鮑菇多肽具有抗氧化和抑菌作用[15-17]，對鉛致大鼠骨骼損傷和氧化損傷具有明顯的緩解作用[18-20]。

目前，杏鮑菇多肽的制備所用到的原料主要為總蛋白，而杏鮑菇中不同種類蛋白水解產(chǎn)物的研究還鮮見報道。因此，以杏鮑菇谷蛋白為原料，通過酶解法制備杏鮑菇谷抗氧化肽，以期為開發(fā)杏鮑菇多肽類產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料

杏鮑菇，市售。

中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、酸性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶均為食品級，河南圣斯德實業(yè)有限公司提供；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，美國Sigma公司提供；Tris、氫氧化鈉、鄰苯三酚、無水乙醇、三氯乙酸、氯化鈉、水楊酸、硫酸亞鐵、無水乙醇、H2O2、鹽酸、鐵氰化鉀、磷酸二氫鈉、碳酸氫二鈉，均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備

HH-2型電子恒溫水浴鍋，天津市賽得利斯實驗分析儀器制造廠產(chǎn)品；ST3100型pH計、AR224CN型電子分析天平，奧豪斯儀器（常州） 有限公司產(chǎn)品；LD5-2B型離心機，北京雷勃爾醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品；UV-1200型紫外-可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 杏鮑菇谷蛋白的提取

以杏鮑菇為原料，在料液比1∶12，提取時間180 min，提取溫度40℃，pH值12，在等電點pH值4.3時沉淀制得。

1.2.2 杏鮑菇谷抗氧化肽的制備流程

杏鮑菇谷蛋白溶液→調(diào)pH值→加蛋白酶酶解→滅酶→離心取上清液。

1.2.3 蛋白酶的篩選

按1.2.2的酶解工藝流程操作，選擇堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、胰蛋白酶、菠蘿蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和酸性蛋白酶在各自最適水解條件下水解杏鮑菇谷蛋白。以酶解液的水解度、·OH清除率、O2-·清除率、DPPH·清除率、總還原力作為考查指標(biāo)，篩選出合適的蛋白酶。

（1）水解杏鮑菇谷蛋白單酶的篩選。在確定每種蛋白酶酶用量的條件下，分別設(shè)定其在各自最適水解條件下水解杏鮑菇谷蛋白，以水解度和O2-·、·OH、DPPH·清除率，總還原力為指標(biāo)，初步篩選出杏鮑菇谷蛋白酶解液抗氧化活性較強的蛋白酶。

（2）水解杏鮑菇谷蛋白雙酶的篩選。通過單酶篩選出5種蛋白酶，設(shè)計出10種雙酶組合水解的方式，蛋白酶種類出現(xiàn)順序即分步水解法的加酶順序。具體水解步驟如下：將杏鮑菇谷蛋白溶液調(diào)節(jié)至第一種蛋白酶水解的最佳條件，加酶反應(yīng)一段時間后，放入100℃的水浴鍋中滅酶，然后冷卻，再將溶液調(diào)節(jié)至第2種蛋白酶水解的最佳條件后加入第2種蛋白酶，水解反應(yīng)一段時間后，于100℃下滅酶。測定杏鮑菇谷蛋白水解產(chǎn)物對水解度、O2-·、·OH、DPPH·的清除率和總還原力的影響。

1.2.4 水解度的測定

采用pH-stat法。

1.2.5 抗氧化指標(biāo)測定

（1） O2-·清除率。將1 mL不同質(zhì)量濃度0.1，0.3，0.5，0.7，0.9 mg/mL的杏鮑菇谷蛋白酶解液分別放入試管中。各加入2 mL Tris-HCl緩沖液，然后將試管放入37℃的水浴鍋中，加熱一段時間后取出與鄰苯三酚反應(yīng)。于波長325 nm處每隔30 s記錄1次OD值，持續(xù)4 min?！鰽為加入杏鮑菇酶解液后鄰苯三酚的自氧化速率；△A0為未加杏鮑菇酶解液的鄰苯三酚自氧化速率。每個試驗重復(fù)3次。

（2）·OH清除率。取1 mL不同質(zhì)量濃度0.1，0.3，0.5，0.7，0.9 mg/mL的杏鮑菇谷蛋白酶解液分別置于試管中；然后加入0.3 mL水楊酸溶液、1 mL FeSO4、0.7 mL H2O2，在勻漿機上混勻后，于37℃下恒溫反應(yīng)30 min，并于波長510 nm處測得OD值（A），（A0）以蒸餾水代替杏鮑菇酶解液。每個試驗重復(fù) 3次。

（3） DPPH·清除率。分別取2 mL不同質(zhì)量濃度0.1，0.3，0.5，0.7，0.9 mg/mL的杏鮑菇谷蛋白酶解液分別置于試管中，與2 mL的DPPH·無水甲醇溶液反應(yīng)，避光條件下放置30 min，于波長510 nm處測定 OD值 （A）。2 mL的 DPPH·無水甲醇溶液和2 mL蒸餾水混合作為對照組（A0）。用2 mL蒸餾水和2 mL無水甲醇調(diào)零。每個試驗重復(fù)3次。

（4） 總還原力。分別取2 mL不同質(zhì)量濃度0.1，0.3，0.5，0.7，0.9 mg/mL的杏鮑菇谷蛋白酶解液置于試管中；加入2.5 mL濃度為0.2 mol/L（pH值6.6）的PBS和2 mL質(zhì)量分數(shù)為1%的 K3[Fe(CN)6]，混勻后，于50℃下恒溫反應(yīng)20 min；再各加入2.5 mL質(zhì)量分數(shù)為10%（W/V） 的TCA，10 min后，以轉(zhuǎn)速4 500 r/min離心20 min，然后取2.5 mL上清液、質(zhì)量分數(shù)為0.1%FeCl30.5 mL和蒸餾水2 mL在試管中反應(yīng)10 min，于波長700 nm處測定OD值。每個試驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 水解杏鮑菇谷蛋白單酶的篩選

2.1.1 不同蛋白酶水解杏鮑菇谷蛋白的水解度

不同蛋白酶的水解度見圖2。

圖2 不同蛋白酶的水解度

由圖2可知，在每種蛋白酶的最適條件下水解杏鮑菇谷蛋白，水解度最高的是堿性蛋白酶為61.22%，其次是風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、菠蘿蛋白酶，其水解度分別為51.32%，50.62%，40.51%，34.91%，21.36%，水解度最低的為酸性蛋白酶，其水解度為4.56%。

2.1.2 不同蛋白酶水解杏鮑菇谷蛋白后對O2-·的清除率

圖3 不同酶解產(chǎn)物對·的清除率

由圖3可知，在試驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，不同杏鮑菇谷蛋白酶解液對O2-·的清除率隨著質(zhì)量濃度的升高呈上升趨勢，當(dāng)溶液質(zhì)量濃度為0.9 mg/mL時，不同蛋白酶解液的清除率由大到小依次為堿性蛋白酶70.19%＞木瓜蛋白酶68.22%＞中性蛋白酶59.10%＞胰蛋白酶54.63%＞風(fēng)味蛋白酶53.76%＞菠蘿蛋白酶37.55%＞酸性蛋白酶24.94%。

2.1.3 不同蛋白酶水解杏鮑菇谷蛋白后對·OH的清除率

不同酶解產(chǎn)物對·OH的清除率見圖4。

由圖4可知，在試驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，不同杏鮑菇谷蛋白酶解液對·OH的清除率隨著質(zhì)量濃度的升高呈上升趨勢，當(dāng)溶液質(zhì)量濃度為0.9 mg/mL時，不同蛋白酶解液的清除率由大到小依次為堿性蛋白酶74.47%＞中性蛋白酶71.32%＞木瓜蛋白酶68.58%＞風(fēng)味蛋白酶63.15%＞胰蛋白酶50.11%＞菠蘿蛋白酶31.72%＞酸性蛋白酶24.32%。

圖4 不同酶解產(chǎn)物對·OH的清除率

2.1.4 不同蛋白酶水解杏鮑菇谷蛋白后對DPPH·的清除率

不同酶解產(chǎn)物對DPPH·的清除率見圖5。

圖5 不同酶解產(chǎn)物對DPPH·的清除率

由圖5可知，在試驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，不同杏鮑菇谷蛋白酶解液對DPPH·的清除率隨著質(zhì)量濃度的升高呈上升趨勢，當(dāng)溶液質(zhì)量濃度為0.9 mg/mL時，不同蛋白酶解液的清除率由大到小依次為堿性蛋白酶74.21%＞木瓜蛋白酶68.49%＞中性蛋白酶66.62%＞風(fēng)味蛋白酶56.76%＞胰蛋白酶49.62%＞菠蘿蛋白酶35.24%＞酸性蛋白酶26.92%。

2.1.5 不同蛋白酶水解杏鮑菇谷蛋白后的總還原力

不同酶解產(chǎn)物的總還原力見圖6。

圖6 不同酶解產(chǎn)物的總還原力

由圖6可知，在試驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，不同杏鮑菇谷蛋白酶解液的總還原力隨著質(zhì)量濃度的升高呈上升趨勢，當(dāng)溶液質(zhì)量濃度為0.9 mg/mL時，不同蛋白酶解液對總還原力的影響由大到小依次為堿性蛋白酶0.179＞中性蛋白酶0.146＞木瓜蛋白酶0.118＞胰蛋白酶0.112＞風(fēng)味蛋白酶0.104＞菠蘿蛋白酶0.094＞酸性蛋白酶0.059。

通過對7種蛋白酶水解杏鮑菇谷蛋白的水解度、O2-·清除率、·OH清除率、DPPH·清除率、總還原力結(jié)果的對比分析，可以看出堿性蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶這5種蛋白酶酶解產(chǎn)物的抗氧化性較好，所以選擇這5種蛋白酶進行下一步的雙酶組合試驗。

2.2 水解杏鮑菇谷蛋白雙酶的篩選

將堿性蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶5種蛋白酶按照1∶1的比例進行兩兩組合，在各自最佳條件下分步酶解杏鮑菇谷蛋白。

2.2.1 不同雙酶組合水解杏鮑菇谷蛋白后的水解度

不同蛋白酶組合的水解度見圖7。

圖7 不同蛋白酶組合的水解度

由圖7可知，杏鮑菇谷蛋白在不同蛋白酶兩兩組合水解的條件下，堿性蛋白酶與胰蛋白酶分步水解，其水解度最高為65.79%，其次是中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶、堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和胰蛋白酶、堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶和中性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶，水解度分別為62.48%，56.83%，54.98%，50.84%，48.54%，45.26%，44.72%，41.87%，最后是風(fēng)味蛋白酶和木瓜蛋白酶，其水解度為39.99%。

2.2.2 不同雙酶組合水解杏鮑菇谷蛋白后對O2-·的清除率

不同雙酶組合酶解液對O2-·的清除率見圖8。

圖8 不同雙酶組合酶解液對O2-·的清除率

由圖8可知，在試驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，不同雙酶組合酶解液對O2-·的清除率隨著質(zhì)量濃度的升高呈上升趨勢，當(dāng)溶液質(zhì)量濃度為0.9 mg/mL時，不同組合蛋白酶解液的清除率由大到小依次為中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶72.32%＞堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶70.03%＞中性蛋白酶和胰蛋白酶68.97%＞木瓜蛋白酶和胰蛋白酶60.05%＞堿性蛋白酶和中性蛋白酶59.40%＞堿性蛋白酶和胰蛋白酶58.74%＞堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶56.45%＞中性蛋白酶和木瓜蛋白酶52.85%＞風(fēng)味蛋白酶和胰蛋白酶50.83%＞木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶47.45%。

2.2.3 不同雙酶組合水解杏鮑菇谷蛋白后對·OH的清除率

不同雙酶組合酶解液對·OH的清除率見圖9。

圖9 不同雙酶組合酶解液對·OH的清除率

由圖9可知，在試驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，不同雙酶組合酶解液對·OH的清除率隨著質(zhì)量濃度的升高呈上升趨勢，當(dāng)溶液質(zhì)量濃度為0.9 mg/mL時，不同雙酶組合酶解液的清除率由大到小依次為中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶73.91%＞中性蛋白酶和胰蛋白酶69.44%＞堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶63.13%＞風(fēng)味蛋白酶和胰蛋白酶61.27%＞中性蛋白酶和木瓜蛋白酶57.38%＞堿性蛋白酶和中性蛋白酶54.39%＞木瓜蛋白酶和胰蛋白酶52.05%＞堿性蛋白酶和胰蛋白酶50.92%＞木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶49.17%＞堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶47.73%。

2.2.4 不同雙酶組合水解杏鮑菇谷蛋白后對DPPH·的清除率

不同雙酶組合酶解液對DPPH·清除率見圖10。

圖10 不同雙酶組合酶解液對DPPH·清除率

由圖10可知，在試驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，不同雙酶組合酶解液對DPPH·的清除率隨著質(zhì)量濃度的升高呈上升趨勢，當(dāng)溶液質(zhì)量濃度為0.9 mg/mL時，不同蛋白酶解液清除率由大到小依次為中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶77.13%＞中性蛋白酶和胰蛋白酶74.98%＞堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶71.44%＞堿性蛋白酶和中性蛋白酶66.84%＞堿性蛋白酶和胰蛋白酶62.23%＞木瓜蛋白酶和胰蛋白酶59.45%＞中性蛋白酶和木瓜蛋白酶53.79%＞堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶52.43%＞風(fēng)味蛋白酶和胰蛋白酶44.10%＞木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶38.93%。

2.2.5 不同雙酶組合水解杏鮑菇谷蛋白后的總還原力不同雙酶組合酶解液的總還原力見圖11。

由圖11可知，在試驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，不同雙酶組合酶解液的總還原力隨著質(zhì)量濃度的升高呈上升趨勢，當(dāng)溶液質(zhì)量濃度為0.9 mg/mL時，不同雙酶組合酶解液對總還原力的影響由大到小依次為中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶0.219＞中性蛋白酶和胰蛋白酶0.193＞木瓜蛋白酶和胰蛋白酶0.173＞堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶0.171＞堿性蛋白酶和胰蛋白酶0.166＞風(fēng)味蛋白酶和胰蛋白酶0.164＞堿性蛋白酶和中性蛋白酶0.159＞中性蛋白酶和木瓜蛋白酶0.156＞堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶0.149＞木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶0.126。

3 結(jié)論

制備出一種具有抗氧化性的谷蛋白多肽，最適水解酶為中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶復(fù)合使用，對O2-·、·OH和DPPH·的清除率為分別為72.32%，73.91%，77.13%，總還原力為0.219。