童曄玲 胡軼娟 # 樓柯浪 陳思思 朱佳依
1 浙江省中醫(yī)藥研究院 浙江 杭州 310007
2 浙江省中藥新藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 浙江 杭州 310007
貓爪草為毛茛科小毛茛Ranunculus ternatus Thunb.的干燥塊根,具有化痰散結(jié)、解毒消腫之功效,用于瘰疬痰核、疔瘡腫毒、蛇蟲咬傷等[1]。在我國(guó)廣泛分布于廣西、臺(tái)灣、江蘇、浙江、江西、湖南、安徽、湖北、河南等省[2]?,F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,貓爪草具有調(diào)節(jié)免疫功能[3]、抗腫瘤[4]、抑菌[5]等作用。貓爪草含有黃酮類及其苷類[6]、內(nèi)酯類、脂肪酸及其酯和甾醇類等[7]。其中穗花杉雙黃酮(Amentoflavone)是貓爪草黃酮類成分中的一個(gè)重要成分,分子式為C30H18O10,藥理學(xué)研究證明其具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤[8]和促骨生成的作用。本文建立了貓爪草中穗花杉雙黃酮的含量測(cè)定方法,為貓爪草質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定提供一定的參考。
1.1 實(shí)驗(yàn)藥品:貓爪草,購自浙江省立同德醫(yī)院中藥房,經(jīng)鑒定為毛茛科植物小毛茛Ranunculus ternatus Thunb.的干燥塊根。穗花杉雙黃酮(A0536):成都曼思特生物科技有限公司。
1.2 儀器:BP211D電子分析天平(萬分之一、十萬分之一):Sartorius;Aligent1260液相色譜儀:四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、DAD檢測(cè)器、柱溫箱;YMC-Pack ODS-A色譜柱(5μm,250×4.6mm);甲醇為色譜純,磷酸為分析純,水為自制超純水。
2.1 色譜條件:色譜柱:YMC-Pack ODS-A(5μm,250×4.6mm)HPLC色譜柱;流動(dòng)相:甲醇-0.05%磷酸溶液;流速:1.0ml/min;檢測(cè)波長(zhǎng):269nm,柱溫:25℃。在此條件下,樣品中穗花杉雙黃酮與相鄰成分達(dá)到基線分離,見圖1。
圖1 對(duì)照品和供試品溶液的高效液相色譜圖
2.2 供試品溶液的制備:取本品粉末約0.5g,精密稱定,置25ml量瓶中,加甲醇適量,超聲處理30min,取出,放冷,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,取續(xù)濾液,即得。進(jìn)樣前用0.45μm微孔濾膜濾過。
2.3 對(duì)照品溶液的制備:精密稱取穗花杉雙黃酮對(duì)照品適量,置容量瓶中,加甲醇制成每毫升含0.1mg的溶液,搖勻,即得。
2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備:分別精密吸取對(duì)照品溶液0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.8ml、1.0ml,置10ml量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,精密吸取10μl,注入液相色譜儀,測(cè)定,記錄峰面積,以峰面積A為縱坐標(biāo),穗花杉雙黃酮的濃度C(μg/ml)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果表明穗花杉雙黃酮在1.16~11.6μg/ml范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(回歸方程為:A=10.012C-1.103,r=0.9997)。
2.5 檢測(cè)限:取穗花杉雙黃酮對(duì)照品溶液,按比例稀釋,測(cè)定檢測(cè)限為1.16ng。
2.6 精密度試驗(yàn):取本品粉末0.5g,共6份,精密稱定,按“2.2供試品溶液的制備”操作,精密吸取10μl,測(cè)定,結(jié)果貓爪草中穗花杉雙黃酮的平均含量為0.0812mg/g,RSD為4.21%。
2.7 加樣回收試驗(yàn):稱取已知含量的同一批樣品6份,精密稱定,置25ml量瓶中,分別精密加入不同量的對(duì)照品溶液,按“2.2供試品溶液的制備”操作,測(cè)定,計(jì)算,平均回收率為98.15%,RSD為3.58%,結(jié)果見表2。
表2 樣品回收率試驗(yàn)結(jié)果
2.8 樣品測(cè)定:分別取5個(gè)不同批號(hào)樣品,按“2.2供試品溶液的制備”操作,并進(jìn)行測(cè)定計(jì)算,結(jié)果見表3。
表3 貓爪草藥材中穗花杉雙黃酮的含量(n=3)
3.1 供試品溶液的制備:超聲提取和加熱回流提取為中藥材有效成分含量測(cè)定中運(yùn)用最多的兩種提取方式,本文對(duì)超聲提取和加熱回流提取兩種方式進(jìn)行了比較,結(jié)果表明兩種提取方式的提取效率相近,由于超聲提取的操作更簡(jiǎn)單方便,本研究選擇超聲提取進(jìn)行供試品溶液的制備。提取溶劑對(duì)提取效率的影響非常大,本研究對(duì)甲醇、乙醇、80%甲醇、80%乙醇、60%甲醇和60%乙醇對(duì)穗花杉雙黃酮的提取效率進(jìn)行了比較,結(jié)果表明甲醇對(duì)貓爪草中穗花杉雙黃酮的提取效率最高,因此本研究選擇甲醇作為提取溶劑。另外,本研究還對(duì)不同超聲提取時(shí)間進(jìn)行了比較,結(jié)果表明,超聲提取30分鐘后,隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng),并不能提高提取效率,故認(rèn)為超聲提取30分鐘已能將穗花杉雙黃酮提取完全,因此確定提取時(shí)間為30分鐘。
3.2 色譜條件:本研究對(duì)各種色譜柱對(duì)穗花杉雙黃酮的分離進(jìn)行了比較,采用依利特Hypersil DBS C18(5μm,4.6mm×250mm)、COSMOSIL(5μm,4.6mm×250mm)、Agilent ZORBAX SB-C18(5μm,4.6mm×250mm)、YMC-pack ODS-A(5μm,4.6mm×250mm)、Thermo Hypersil GOLD(5μm,4.6mm× 250mm)、SUPELCO C18(5μm,4.6mm×250mm)等6種色譜柱進(jìn)行實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明,穗花杉雙黃酮在這六種色譜柱上都能得到較好的分離。本研究還對(duì)流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行了考察,比較了甲醇-磷酸系統(tǒng)和乙腈-磷酸系統(tǒng),結(jié)果表明這兩種流動(dòng)相系統(tǒng)都能對(duì)穗花杉雙黃酮進(jìn)行較好的分離。
3.3 與現(xiàn)有的貓爪草質(zhì)量控制方法比較:貓爪草為《中國(guó)藥典》2015年版一部收錄的品種,對(duì)其質(zhì)量控制主要是通過性狀鑒別、顯微鑒別和薄層鑒別進(jìn)行,缺乏定量控制方法。有學(xué)者對(duì)貓爪草中成分的定量分析進(jìn)行了研究,吳曉等對(duì)貓爪草中的總糖、多糖含量進(jìn)行了測(cè)定[9],池玉梅等以蘆丁為對(duì)照品對(duì)貓爪草藥材中總黃酮的含量進(jìn)行了測(cè)定[10],還有學(xué)者對(duì)貓爪草的揮發(fā)性成分進(jìn)行了分析[11]。但上述研究均未對(duì)代表貓爪草生理活性的單一成分進(jìn)行研究。本文對(duì)貓爪草中穗花杉雙黃酮的含量進(jìn)行測(cè)定,并建立了含量測(cè)定方法,可以為貓爪草的質(zhì)量控制指標(biāo)的確定提供一定的參考。