陽和湯藥組配伍對不同期Lewis 肺癌荷瘤小鼠的抑瘤效應及Th1/Th2 漂移的影響*

★ 葉崢嶸 吳琳（1.陜西中醫(yī)藥大學 陜西 咸陽 71046；.咸陽市中心醫(yī)院 陜西 咸陽 71000）

溫陽法在中醫(yī)藥治療腫瘤方面具有著廣泛的實踐基礎，而在其具體的處方和藥物使用中存在著溫陽散寒和溫補腎陽單用及相互配伍的情況［1］。從生物醫(yī)學角度深入分析它們的抑瘤效應和適用階段及作用機制，對進一步發(fā)揮溫陽法治療腫瘤的作用具有重要的意義。做為治療陰疽的經(jīng)典效方，陽和湯治療腫瘤具有著一定的理論依據(jù)與實踐基礎，而其組方中存在著溫陽散寒藥組和溫補腎陽藥組相互配伍使用的情況［2］。前期的研究結(jié)果表明，陽和湯溫陽散寒藥組和溫補腎陽藥組及兩藥組合用藥組對同期荷瘤小鼠的腫瘤生長具有抑制作用［3］。本研究探討了陽和湯中的兩組藥物各自及相互配伍對不同時期Lewis 肺癌荷瘤小鼠的抑瘤效應及Th1/Th2 漂移的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗藥物 陽和湯溫補腎陽藥組為熟地黃30 g，鹿角膠9 g；陽和湯溫陽散寒藥組為肉桂3 g，麻黃2 g，白芥子6 g，炮姜炭2 g；陽和湯兩藥組合用藥為熟地黃30 g，鹿角膠9 g，肉桂3 g，麻黃2 g，白芥子6 g，炮姜炭2 g。上述三組藥物均購買于西安中藥飲片有限責任公司，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學藥學院中藥鑒定學教研室鑒定，按所列計量精確稱取，分別用500 mL水常規(guī)煎制并按人體用量的10 倍濃縮定容（其中含鹿角膠的打粉烊化），使其分別形成相當于生藥0.65 g/mL、0.22 g/mL 和0.87 g/mL 的藥液，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 動物和瘤株 分隔5 天先后從西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心購買兩批一月齡清潔級昆明種雄性小鼠50 只，體重18～20 g，許可證號SCXK（陜）2012-003，適應性喂養(yǎng)兩天后造模。Lewis 肺癌瘤細胞株由第四軍醫(yī)大學實驗動物研究中心提供，攜帶于C57BL/6 小鼠右腋皮下。

1.3 儀器和試劑 超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；蔡氏生物顯微鏡（德國）；RT-2100C 酶標分析儀（深圳市雷杜電子有限公司）；FA1104N電子天平（上海精密科學儀器有限公司）；SHH.W21 三用電子恒溫水箱（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；LD4-2 低速離心機（北京醫(yī)用離心機廠）；白細胞介素-2（IL-2）和白細胞介素-4（IL-4）酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒（陜西博達生物科技有限公司）。眼科手術(shù)器械、細胞記數(shù)板、微量移液器和臺盼藍染液等均由陜西中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合免疫研究室提供。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物造模 先后兩次以相同的方法將負荷在C57BL/6 小鼠右腋皮下的Lewis 肺癌瘤塊在無菌環(huán)境下剝離，不銹鋼網(wǎng)過濾制成無菌單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度至1×107/mL，臺盼藍拒染實驗顯示活細胞比例大于95%。分別將上述前后兩批50 只昆明種小鼠隨機分為陽和湯溫補腎陽藥組（6.5 g/kg）、陽和湯溫陽散寒藥組（2.2 g/kg）、陽和湯兩藥組合用組（8.7 g/kg）、模型對照組和正常對照組，每組10 只。除正常對照組外，其余各組小鼠接種上述細胞懸液于小鼠右腋皮下（0.2 mL/只）。

1.4.2 用藥方法 上述第二批小鼠造模5 天后形成荷瘤5 天的實驗動物模型時，第一批小鼠已形成荷瘤10 天的實驗動物模型，隨即開始灌胃。正常對照組和模型對照組用生理鹽水，陽和湯兩藥組合用組、陽和湯溫腎補陽組和陽和湯溫陽散寒組用上述制備藥液連續(xù)灌胃10 天，0.2mL/次，1次/天。

1.5 指標檢測

1.5.1 小鼠體重、脾指數(shù)、胸腺指數(shù)和抑瘤率 灌胃結(jié)束后量各組小鼠體重，處死小鼠剝離脾臟、胸腺和右腋皮下瘤塊并稱取重量，計算抑瘤率和脾指數(shù)與胸腺指數(shù)。抑瘤率（%）=（1-給藥組平均瘤重/模型組平均瘤重）×100%，脾臟（胸腺）指數(shù)=脾臟（胸腺）重量（mg）/體重（g）。

1.5.2 小鼠血清IL-2 和IL-4 含量 灌胃結(jié)束后，在處死小鼠前，摘眼球取各組小鼠血液，離心獲取血清，ELISA 法檢測其中的IL-2 和IL-4 含量，并與正常對照組比較。具體方法為在96 孔包被板中設六孔標準孔，倍比稀釋標準品稀釋液，每孔加入100 μL，并設空白對照孔和零孔。樣品孔每孔依次加入上述待測血清100 μL，37 ℃溫育90 min 后洗滌各孔，每孔（除零孔）加入第一抗工作液50 μL，37 ℃溫育60 min，再次洗板，每孔（除零孔）加入酶聯(lián)工作液100 μL，37 ℃溫育30 min，用洗滌液洗板后，每孔加入TMB 顯色劑A、B 各一滴，37 ℃避光顯色15 min，在每孔中加終止液一滴，輕輕混合，酶聯(lián)檢測儀450 nm 處測OD，根據(jù)標準曲線，分別檢測各組小鼠血清IL-2 和IL-4 濃度。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 采用SPSS13.0 軟件包（SPSS Inc.，Chicago，IL）處理數(shù)據(jù)，計量資料均數(shù)±標準差（）表示，兩兩比較采用q 檢驗，P<0.05 具有統(tǒng)計學意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 對不同期Lewis 肺癌荷瘤小鼠的抑瘤效應 由于實驗過程中灌胃操作技術(shù)的失誤，荷瘤5 天的陽和湯溫腎補陽組和陽和湯兩藥組合用組各有一只小鼠死亡。在荷瘤5 天的Lewis 肺癌荷瘤小鼠中，與模型對照組和陽和湯溫補腎陽藥組比較，陽和湯溫陽散寒藥組和陽和湯兩藥組合用組的移植瘤生長明顯受到抑制（P<0.01）。在荷瘤10 天的Lewis肺癌荷瘤小鼠中，與模型對照組比較，陽和湯溫補腎陽藥組和陽和湯溫陽散寒藥組的移植瘤生長均受到抑制（P<0.05），陽和湯兩藥組合用組的移植瘤生長抑制更明顯（P<0.01）；與陽和湯溫陽散寒藥組比較，陽和湯兩藥組合用組的移植瘤生長受到抑制（P<0.05）。結(jié)果見表1。

表1 對Lewis肺癌荷瘤小鼠的抑瘤效應（）

表1 對Lewis肺癌荷瘤小鼠的抑瘤效應（）

注：與模型對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

2.2 對不同期Lewis 肺癌荷瘤小鼠體重、脾指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響 在荷瘤5 天的Lewis 肺癌荷瘤小鼠中，與正常對照組比較，模型對照組荷瘤小鼠體重、脾指數(shù)和胸腺指數(shù)無異常。與模型對照組比較，陽和湯溫補腎陽藥組脾指數(shù)升高（P<0.05），陽和湯溫陽散寒藥組胸腺指數(shù)降低（P<0.05）。陽和湯溫陽散寒藥組脾指數(shù)和胸腺指數(shù)較陽和湯溫補腎陽藥組降低（P<0.05）；在荷瘤10 天的Lewis 肺癌荷瘤小鼠中，與正常對照組比較，模型對照組荷瘤小鼠體重和胸腺指數(shù)均明顯降低（P<0.01），脾指數(shù)也降低（P<0.05）。陽和湯溫補腎陽藥組和陽和湯兩藥組合用組的荷瘤小鼠體重、脾指數(shù)和胸腺指數(shù)較模型對照組升高（P<0.05）。陽和湯溫補腎陽藥組荷瘤小鼠胸腺指數(shù)較陽和湯溫陽散寒藥組升高（P<0.05）。結(jié)果見表2。

表2 對Lewis肺癌荷瘤小鼠體重、脾指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響（）

表2 對Lewis肺癌荷瘤小鼠體重、脾指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響（）

注：與正常對照組比較，★P＜0.05，★★P＜0.01；與模型對照組比較，*P＜0.05

2.3 對荷瘤5 天的Lewis 肺癌荷瘤小鼠Th1/Th2 漂移的血清標志性細胞因子IL-2 和IL-4 的影響 與正常對照組比較，模型對照組荷瘤小鼠血清IL-2含量降低（P<0.01），IL-4 的含量升高（P<0.01）。與模型對照組比較，陽和湯溫補腎陽藥組和陽和湯溫陽散寒藥組荷瘤小鼠血清IL-2 的含量升高（P<0.05），陽和湯兩藥組合用組荷瘤小鼠血清IL-2 的含量明顯升高（P<0.01），陽和湯溫陽散寒藥組和陽和湯兩藥組合用組荷瘤小鼠血清IL-4 的含量明顯降低（P<0.01）；與陽和湯溫補腎陽藥組比較，陽和湯兩藥組合用組荷瘤小鼠血清IL-2 的含量升高（P<0.05），陽和湯溫陽散寒藥組和陽和湯兩藥組合用組荷瘤小鼠血清IL-4 的含量降低（P<0.05）。結(jié)果見表3。

表3 對荷瘤5天的Lewis肺癌荷瘤小鼠血清IL-2和IL-4含量的影響（） ng/mL

表3 對荷瘤5天的Lewis肺癌荷瘤小鼠血清IL-2和IL-4含量的影響（） ng/mL

注：與正常對照組比較，★★P＜0.01；與模型對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.4 對荷瘤10 天Lewis 肺癌荷瘤小鼠Th1/Th2 漂移的血清標志性細胞因子IL-2 和IL-4 的影響 與正常對照組比較，模型對照組荷瘤小鼠血清IL-2 含量仍然明顯降低（P<0.01），IL-4 的含量仍然明顯升高（P<0.01）。與模型對照組比較，陽和湯溫補腎陽藥組和陽和湯兩藥組合用組荷瘤小鼠血清IL-2 的含量明顯升高（P<0.01），陽和湯溫補腎陽藥組和陽和湯溫陽散寒藥組荷瘤小鼠血清IL-4 的含量降低（P<0.05），而陽和湯兩藥組合用組荷瘤小鼠血清IL-4 的含量降低更明顯（P<0.01）；與陽和湯溫陽散寒藥組比較，陽和湯溫補腎陽藥組荷瘤小鼠血清IL-2 含量升高（P<0.05），陽和湯兩藥組合用組荷瘤小鼠血清IL-2 含量明顯升高（P<0.01）；與陽和湯溫補腎陽藥組比較，陽和湯兩藥組合用組荷瘤小鼠血清IL-2 含量明顯升高（P<0.01）。結(jié)果見表4。

表4 對荷瘤10天的Lewis肺癌荷瘤小鼠血清IL-2和IL-4含量的影響（） ng/mL

表4 對荷瘤10天的Lewis肺癌荷瘤小鼠血清IL-2和IL-4含量的影響（） ng/mL

注：與正常對照組比較，★★P＜0.01；與模型對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3 討論

腫瘤歸屬于中醫(yī)學“癥瘕”“積聚”“臟結(jié)”等病證的范疇［4］?！鹅`樞·五變篇》曰：“腸胃之間，寒溫不次，邪氣稍至，蓄積留止，寒多則氣澀，氣澀則生積聚也。”《傷寒論》130 條：“臟結(jié)無陽證，不往來寒熱，其人反靜，舌上胎滑者，不可攻也。”《素問玄機原病式》指出：“癥瘕頹疝，堅痞腹?jié)M……皆屬于寒?！贬槍δ[瘤這一有形之物，根據(jù)“積之始生，得寒乃生，厥乃成積”的理論，應選擇溫陽散寒使凝結(jié)消散；結(jié)合“陽化氣，陰成形”和“人之一身陽氣藏于腎中”的認識，應采用溫補腎陽來治療腫瘤。陽和湯出自《外科證治全生集》，方中熟地溫補陰血、填精益髓，鹿角膠溫補精血、補益腎陽。二者共用，正所謂“善補陽者，當以陰中求陽，則陽得陰助，而生化無窮”，發(fā)揮著溫補腎陽的功效；肉桂和炮姜炭入血分而溫經(jīng)散寒、溫通血脈，白芥子辛溫通絡散結(jié)，麻黃辛溫宣散寒凝而開肌腠。四藥合用，發(fā)揮著溫陽散寒的作用。上述兩組藥物配伍使用，針對漫腫不紅且堅硬如石的陰疽，標本兼治，虛實兼顧。生甘草則發(fā)揮著調(diào)和諸藥的作用?！锻饪谱C治全生集》中的陰疽包括“乳巖”“惡核”“失榮”“石疽”等疾病，此類疾患相當于現(xiàn)代醫(yī)學的腫瘤［5］。上述研究發(fā)現(xiàn)，陽和湯溫陽散寒藥組和陽和湯兩藥組合用對荷瘤5 天的Lewis 肺癌荷瘤小鼠具有明顯的抑瘤效應；陽和湯溫陽散寒藥組和陽和湯溫補腎陽藥組對荷瘤10 天的Lewis 肺癌荷瘤小鼠有抑瘤效應，且陽和湯兩藥組合用小鼠對其的抑瘤效應更明顯。此結(jié)果表明溫陽散寒法和溫補腎陽法單用和配伍使用在治療腫瘤中存在著階段的差異性。

腫瘤患者的病機是“整體為虛，瘤部為實”［6］。在寒積陽虛中，整體的虛是機體腎陽不足生化之源虧乏，致使寒邪內(nèi)生，氣化異常，血瘀痰凝逐漸形成；瘤部的實是局部寒凝津阻血瘀痰凝，表現(xiàn)為癥瘕、積聚和臟結(jié)等不斷加劇的腫塊及疼痛，日久則易耗氣奪血，損傷陽氣。腫瘤患者的全身衰弱，是局部腫瘤之邪所致，而全身衰弱又可促使局部腫瘤之邪亢盛，這種反復惡性循環(huán)，終致不治［7］。辨證論治是中醫(yī)的基本特點，準確把握病性的虛實繼而選用恰當?shù)闹蝿t治法并處方用藥以期達到“方證對應”，是獲得臨床療效的關(guān)鍵。因此在溫陽法治療腫瘤的具體應用中，針對虛實病性扶正的溫補腎陽和祛邪的溫陽散寒應準確辨證，掌握適當?shù)臅r機和分寸［8］。上述實驗結(jié)果表明，陽和湯溫陽散寒藥組和具有溫陽散寒藥物的陽和湯兩藥組合用組對荷瘤5 天的Lewis 肺癌荷瘤小鼠具有明顯的抑瘤效應，表明此階段荷瘤機體可能存在著寒凝淤滯的邪實病機。而此時機體的正虛尚不明顯，所以陽和湯溫補腎陽藥組對其無抑瘤效應；在荷瘤10 天的Lewis 肺癌荷瘤小鼠體內(nèi)，明顯增大的腫瘤組織不僅進一步體現(xiàn)著邪實的病機，而且出現(xiàn)腫瘤增殖耗損氣血的正虛狀態(tài)，陽和湯溫陽散寒藥組針對邪實發(fā)揮作用，陽和湯溫補腎陽藥組針對正虛產(chǎn)生效應，兩藥組均有較好的抑制腫瘤生長的作用。而陽和湯兩藥組合用組攻邪和扶正兼顧，所以在抑瘤方面的作用更為明顯。

1986 年Mosmann 等［9］發(fā)現(xiàn)小鼠CD4+T 細胞按細胞因子產(chǎn)生的模式和生物功能具有Th1 細胞和Th2 細胞兩種不同的亞群。人類同樣存在著這兩個T 細胞亞群［10］。其中Th1 細胞分泌IL-2 和IFN-γ等促進細胞免疫，Th2 細胞分泌IL-4 和IL-5 等參與體液免疫。正常情況下機體中Th1/Th2 細胞處于相對平衡的狀態(tài)，分別分泌著各自的細胞因子彼此交叉調(diào)節(jié)、互相抑制［11］，形成一種動態(tài)的細胞因子網(wǎng)絡。但在機體發(fā)生功能異常時，常表現(xiàn)出平衡偏向其中一方，此即為“Th1/Th2 平衡漂移”，進而引起許多疾病的產(chǎn)生和發(fā)展。近年來Th1/Th2 細胞亞群狀態(tài)已成為腫瘤免疫治療的研究熱點［12］。Th1細胞誘導的免疫應答是抑制惡性腫瘤增生所必需的，腫瘤抗原特異性的Th1 細胞可自動回到腫瘤周圍并分泌細胞因子，從而增強腫瘤微環(huán)境中的抗原提呈細胞的功能［13］。有研究表明，腫瘤患者處于Th2 細胞優(yōu)勢的分化狀態(tài)，其產(chǎn)生的細胞因子對Th1 細胞增殖分化和細胞毒性T 淋巴細胞的功能具有抑制作用，從而導致機體抗腫瘤免疫功能減弱，使腫瘤細胞逃逸免疫監(jiān)視和免疫攻擊［14］。在腫瘤進程中，由Th1/Th2 平衡至Th2 占主導地位的轉(zhuǎn)換是至關(guān)重要的因素，恢復Th1 和Th2 細胞之間的平衡狀態(tài)在腫瘤的治療中具有重要意義［15］。上述研究結(jié)果表明，荷瘤5 天和10 天的模型對照組小鼠血清IL-2 含量明顯低于正常對照組，IL-4 含量明顯高于正常對照組，均存在著Th1/Th2 平衡漂移向Th2 優(yōu)勢分化的情況，且荷瘤10 天的Lewis 肺癌荷瘤小鼠Th2 居于主導地位的情況更明顯。針對荷瘤5 天的Lewis 肺癌荷瘤小鼠，陽和湯溫陽散寒藥組和陽和湯兩藥組合用不僅提高著Th1 細胞因子IL-2 的含量，更降低著Th2 細胞因子IL-4 含量，通過調(diào)節(jié)荷瘤機體內(nèi)存在Th2 優(yōu)勢分化的Th1/Th2平衡漂移發(fā)揮著抑瘤作用。針對荷瘤10 天的Lewis肺癌荷瘤小鼠，陽和湯溫陽散寒藥組、陽和湯溫補腎陽藥組和陽和湯兩藥組合用均對移植瘤的生長發(fā)揮著抑制作用。它們的抑瘤作用機制可能與降低荷瘤小鼠血清細胞因子IL-4 含量有關(guān)，而溫補腎陽藥組和陽和湯兩藥組合用藥的作用機制與提高荷瘤小鼠體重、脾指數(shù)和胸腺指數(shù)及血清Th1 細胞因子IL-2 含量關(guān)系密切，從而使荷瘤機體內(nèi)Th1/Th2 平衡漂移向Th1 占主導的地位轉(zhuǎn)換。