建立靶向CXCR7基因的CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)及其應(yīng)用

吳潔瑩 孫遜沙 李發(fā)濤 陳勁松 謝閨娥 李 焱 吳韶清

1 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣州市婦女兒童醫(yī)療中心(廣州 510623) 2 中山大學(xué)附屬廣州市婦女兒童醫(yī)療中心(廣州 510623) 3 中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院(廣州 510080) 4 廣州醫(yī)科大學(xué)金域檢驗(yàn)學(xué)院(廣州 510182)

近年來，CRISPR/Cas9(the clustered regularly interspaced short palindromicrepeats /CRISPR-associated protein 9)基因編輯技術(shù)應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域是研究熱點(diǎn)之一，具有重要的研究意義和實(shí)際應(yīng)用價值[1-2]。相對于歸巢核酸內(nèi)切酶、鋅指核酸酶和轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶技術(shù)，CRISPR/Cas9能夠精準(zhǔn)、快速、有效地實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的編輯，而且實(shí)驗(yàn)操作簡單及成本低廉[3]。本研究擬構(gòu)建靶向CXCR7基因的CRISPR/Cas9質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞系HEK293T，編輯CXCR7基因，為進(jìn)一步研究CXCR7基因在干細(xì)胞中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、質(zhì)粒及相關(guān)試劑

HEK293T細(xì)胞由中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院楊中漢教授饋贈；CRISPR/Cas9 骨架質(zhì)粒pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) 由北京微旋基因技術(shù)有限公司饋贈；大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α購自天根生化(北京)科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco公司；Lipofectemine 3000購自Invitrogen公司；菌液PCR試劑盒購自北京擎科生物科技有限公司；Bbs I酶、PNK酶和連接酶購自NewEngland Biolabs公司；無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)mega公司。

1.2 方法

1.2.1 設(shè)計(jì)靶向編輯CXCR7基因的sgRNA

利用http://cripr.mit.edu 網(wǎng)站設(shè)計(jì)單鏈導(dǎo)向RNA(single guide RNA，sgRNA)，選擇具有高度特異性且脫靶可能性低的sgRNA，本研究選擇其中兩對sgRNA進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究(見表1)，這兩對sgRNA 的靶向位點(diǎn)均位于CXCR7基因的第2號外顯子上。

1.2.2 構(gòu)建sgRNA-CXCR7-PX458 質(zhì)粒

將合成的sgRNA按照文獻(xiàn)方法進(jìn)行末端磷酸化和退火[1]，并以1:200 的比例稀釋。BbsⅠ酶切PX458，純化后連接sgRNA。取連接體系2 μL轉(zhuǎn)化大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，接種于含50 mg/mL氨芐西林的平板上，12～16 h后，每個平板選擇3 個單菌落，分別含50 mg/mL氨芐西林的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)16～18 h。按照質(zhì)粒提取試劑盒說明書進(jìn)行質(zhì)粒抽提，用PCR擴(kuò)增抽提質(zhì)粒，上游引物用U6-F，下游引物用各sgRNA的bottom序列(見表1)，然后用上游引物進(jìn)行Sanger測序鑒定。正確的質(zhì)粒分別標(biāo)記為sgRNA1-CXCR7-PX458質(zhì)粒和sgRNA2-CXCR7-PX458質(zhì)粒。

表1 sgRNA和引物序列

續(xù)表

1.2.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞系

按照2×105個/孔的密度接種HEK 293T 細(xì)胞到24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，24 h后，按照Lipofectamine 3000試劑盒說明書操作指南，每孔轉(zhuǎn)染sgRNA1-CXCR7-PX458質(zhì)?；騭gRNA2-CXCR7-PX458質(zhì)粒500 ng，72 h后采用流式細(xì)胞儀(BD FACS Aria Sorp)分選出表達(dá)GFP陽性的HEK 293T細(xì)胞，擴(kuò)增培養(yǎng)后，小部分細(xì)胞用于提取基因組DNA，大部分細(xì)胞液氮中冷凍保存?zhèn)溆?。提取DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后進(jìn)行Sanger 測序。

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建2個sgRNA-CXCR7-PX458質(zhì)粒

sgRNA-CXCR7和PX458 載體質(zhì)粒骨架連接后，sgRNA-CXCR7-PX458質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，經(jīng)鋪板和菌落培養(yǎng)，提取的質(zhì)粒DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增(見圖1)和Sanger 測序鑒定，2個sgRNA 分別插入PX458 質(zhì)粒相應(yīng)位置，測序結(jié)果見圖2，顯示sgRNA 插入了正確的位置。

圖1 sgRNA-CXCR7-PX458擴(kuò)增電泳圖

圖2 sgRNA-CXCR7-PX458質(zhì)粒測序結(jié)果

2.2 兩個sgRNA-CXCR7-PX458質(zhì)粒分別成功轉(zhuǎn)染至HEK 293T細(xì)胞

將sgRNA1-CXCR7-PX458質(zhì)粒和sgRNA2-CXCR7-PX458質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞，72 小時后，采用流式細(xì)胞儀分選GFP陽性細(xì)胞，以未轉(zhuǎn)染的HEK 293T細(xì)胞為陰性對照，設(shè)定GFP的陰性邊界，結(jié)果顯示，sgRNA1-CXCR7-PX458質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HEK 293T 細(xì)胞中有23.42%表達(dá)GFP，sgRNA2-CXCR7-PX458質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HEK 293T細(xì)胞中有22.30%表達(dá)GFP。見圖3。

圖3 轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞系72h采用流式細(xì)胞術(shù)分選GFP陽性細(xì)胞

2.3 HEK 293T 細(xì)胞中的CXCR7基因被有效編輯

經(jīng)Sanger 測序鑒定，sgRNA1-CXCR7-PX458質(zhì)粒轉(zhuǎn)染過的HEK293T細(xì)胞在第112與113位編碼氨基酸之間產(chǎn)生了插入和/或缺失(NP_064707.1)，sgRNA2-CXCR7-PX458質(zhì)粒轉(zhuǎn)染過的HEK 293T細(xì)胞在第87與88位編碼氨基酸之間產(chǎn)生了插入和(或)缺失，均為PAM之前3個堿基左右的位置，即Cas9切割雙鏈DNA的位置，產(chǎn)生了重疊峰的圖像，表明此處發(fā)生插入和/或缺失，因而，CXCR7基因被有效編輯。見圖4。

圖4 HEK293T細(xì)胞CXCR7基因被編輯后的測序圖

3 討論

CRISPR 系統(tǒng)由CRISPR基因簇和Cas蛋白組成，在細(xì)菌和古細(xì)菌中參與獲得性免疫防御，降解噬菌體等外源的遺傳物質(zhì)。具體的機(jī)制為：當(dāng)噬菌體首次進(jìn)入宿主細(xì)胞后，CRISPR系統(tǒng)識別其核酸及外源DNA的PAM序列(protospacer sdjacent motif)，選取一段DNA序列加工重組到CRISPR簇的5′端，形成新的非重復(fù)間隔序列，從而將外來的基因片段整合進(jìn)細(xì)菌細(xì)胞的基因組。當(dāng)具有相同核酸序列的噬菌體再次入侵時，CRISPR系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄出前體crRNA，加工成熟后與相關(guān)的Cas蛋白結(jié)合形成crRNA-Cas9蛋白復(fù)合體，然后通過堿基互補(bǔ)配對結(jié)合外源DNA并切割，使得形成DNA雙鏈缺口(double stranded breaks，DSB)，從而激活細(xì)胞的修復(fù)機(jī)制。細(xì)胞通過兩種機(jī)制進(jìn)行修復(fù)，一種是非同源末端連接修復(fù)機(jī)制，此時可能產(chǎn)生幾個堿基的插入或者缺失，導(dǎo)致相應(yīng)基因發(fā)生移碼突變或者無義突變，從而實(shí)現(xiàn)基因的敲除；另一種是通過同源重組機(jī)制修復(fù)，可以將外源性基因準(zhǔn)確插入基因組[4-5]。CRISPR/Cas 9基因編輯技術(shù)自2013年首次應(yīng)用以來，迅速被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，并獲得不少進(jìn)展和成果[1,6]。

采用CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯干細(xì)胞內(nèi)的相關(guān)基因，進(jìn)行干/祖細(xì)胞分化、疾病模型建立、藥物篩選和再生醫(yī)學(xué)等方面的研究[7-8]。Negoro R等[9]建立了多重耐藥基因(Multiple drug resistance 1，MDR1)敲除的人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(human induced pluripotent stemcells，iPSCs)，能夠用于藥物代謝動力學(xué)研究。Wang H等[10]用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除人胚胎干細(xì)胞的肌段同源盒2基因(muscle segment homeobox2，MSX2)，誘導(dǎo)該細(xì)胞分化成造血干細(xì)胞，證明該基因是胚胎干細(xì)胞分化成造血干細(xì)胞的調(diào)控基因。Golchin A等[11]認(rèn)為間充質(zhì)干細(xì)胞作為一種安全有效的細(xì)胞治療資源，同CRISPR/Cas9系統(tǒng)的聯(lián)合應(yīng)用，將會極大地提高其臨床利用價值和效果。Kim YK等[12]用正常人來源的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，建立了α-半乳糖苷酶缺失的細(xì)胞系，為法布瑞氏癥的基礎(chǔ)研究提供可靠的手段，為該罕見病的治療開發(fā)新方案提供了奠定了基礎(chǔ)。

趨化因子受體7(C-X-C chemokine receptor 7, CXCR7)是G蛋白偶聯(lián)的七次跨膜蛋白受體(seven-transmembrane receptors，7-TMRs)，其基因定位于人類染色體2q37，作為CXCL12的第二受體，親和性比CXCR4高10倍。CXCR7基因最初是從狗的甲狀腺cDNA序列中分離出來的。目前已知，正常情況下，CXCR7在人的心臟、腦、脾、腎、肺、睪丸、卵巢、甲狀腺和胎盤等組織中是高表達(dá)的，肝以及胸腺中表達(dá)量較低。在造血系統(tǒng)，CXCR7主要表達(dá)于外周血的單核細(xì)胞、粒細(xì)胞和血小板以及骨髓中的淋巴細(xì)胞和粒細(xì)胞上[13-14]。而在疾病相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，在炎癥、感染、缺血和腫瘤形成中，CXCR7的表達(dá)是上調(diào)的。另外，人類微血管內(nèi)皮細(xì)胞在缺氧和酸性環(huán)境下，其CXCR7表達(dá)也是上調(diào)的。CXCR7廣泛參與多種生物學(xué)功能，包括炎性應(yīng)答、免疫應(yīng)答、免疫監(jiān)控和組織修復(fù)再生。CXCR7具有促進(jìn)血管新生能力，包括胚胎發(fā)育中的血管發(fā)生，以及腫瘤生長和轉(zhuǎn)移過程中的新生血管形成。已有報道表明，CXCR7在調(diào)控細(xì)胞遷移、黏附、增殖、存活和分化等方面具有重要作用[15-16]。

近年來，干細(xì)胞技術(shù)發(fā)展迅速，干細(xì)胞的基礎(chǔ)研究和干細(xì)胞的臨床應(yīng)用已經(jīng)成為了目前生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最活躍的研究熱點(diǎn)之一。由于CXCR7在細(xì)胞研究領(lǐng)域的重要作用，使得CXCR7在胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞中的功能研究不斷被報道。如Kowalski K等[17]報道，CXCR7對調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育過程中的關(guān)鍵發(fā)育調(diào)節(jié)子表達(dá)是必需的，而且CXCR7參與了胚胎干細(xì)胞多能性的控制和向中胚層譜系的分化。Shao Y等[18]發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)CXCR7的間充質(zhì)干細(xì)胞明顯促使間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢至受損的肺組織，同時促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞的分化，并增強(qiáng)了間充質(zhì)干細(xì)胞調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的能力。Chen Q等[19]報道，CXCR7在神經(jīng)祖細(xì)胞遷移中起重要作用，在CXCR4缺失的情況下，CXCR7激活細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)1/2，并充當(dāng)CXCL12介導(dǎo)的神經(jīng)祖細(xì)胞遷移的功能受體。

綜上所述，建立靶向CXCR7的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)，對研究CXCR7的功能具有重要意義，本研究建立了該編輯系統(tǒng)，并在人胚腎細(xì)胞系HEK293T 中成功進(jìn)行了CXCR7基因的編輯，為進(jìn)一步的干細(xì)胞中的CXCR7基因編輯和功能研究奠定基礎(chǔ)。