芫荽提取物對(duì)秀麗隱桿線蟲體內(nèi)抗氧化活性的初步探究

劉 暢,徐 悅,單承鶯,朱昌玲,趙 飛,張煥仕,*

(1.南京野生植物綜合利用研究院,江蘇南京 211100;2.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,江蘇南京 210023)

芫荽(CoriandrumsativumL.)俗稱香菜,屬一年或兩年生的傘形科草本,是一種藥食兩用的香料植物。芫荽性溫味辛入肺脾經(jīng),營養(yǎng)成分豐富、保健功能強(qiáng),含有多種對(duì)人體有益的活性物質(zhì),具有抗氧化、抗菌、降血糖、抗炎癥等功能,還有報(bào)道稱其具解毒的效果[1-2]。近年來,香辛食品植物的抗氧化活性得到了廣泛的關(guān)注和研究,其中芫荽的抗氧化功能更是成為國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)[3-5]。目前,芫荽的抗氧化研究大多注重以體外清除自由基活性能力為主[6-7],體內(nèi)實(shí)驗(yàn)還鮮見報(bào)道,不利于多方位了解芫荽的生物學(xué)功能和潛在開發(fā)價(jià)值。

秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)簡(jiǎn)稱線蟲,屬于線蟲動(dòng)物門小干線蟲屬,是一種體積小、易飼養(yǎng)且操作簡(jiǎn)便的模式生物,其神經(jīng)、消化、生殖系統(tǒng)與哺乳動(dòng)物具有高度同源性[8-10],受到了遺傳學(xué)、藥理學(xué)、發(fā)育學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)等眾多生物領(lǐng)域研究者的高度重視,被廣泛應(yīng)用于生物實(shí)驗(yàn)的前期探索過程中,是一種可用于物質(zhì)性質(zhì)評(píng)價(jià)和機(jī)制探究的經(jīng)濟(jì)便捷的模式生物[11-12]。

百草枯(Paraquat,PQ),化學(xué)名為1,1′-二甲基4-4′-聯(lián)吡啶二氯化物,是一種劇毒的非選擇接觸性季銨類除草劑。PQ毒性損害機(jī)制主要包括氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、核轉(zhuǎn)錄因子過度表達(dá)、凋亡等,其中氧化應(yīng)激反應(yīng)在PQ中毒機(jī)體損傷中發(fā)揮主要作用。PQ作為電子受體可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生大量活性氧(Reactive oxygen species,ROS),造成細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化,產(chǎn)生氧化損傷,破壞機(jī)體自身氧化物及細(xì)胞內(nèi)防御系統(tǒng)狀態(tài)平衡[13-14]。因此,本研究用百草枯作為自由基引發(fā)劑來探討秀麗隱桿線蟲在氧化脅迫后,芫荽提取物對(duì)生物體的抗氧化作用。

在秀麗隱桿線蟲中,胰島素/IGF-1(IIS)信號(hào)通路是一條進(jìn)化上保守的內(nèi)分泌通路,能夠調(diào)節(jié)各種生物的壽命并讓生物在受迫的條件下存活,其中daf-2和daf-16是該信號(hào)通路中的兩個(gè)關(guān)鍵基因[15]。daf-2是哺乳動(dòng)物胰島素/IGF受體的同源物,daf-16是FOXO轉(zhuǎn)錄因子同系物。激活的daf-2會(huì)與INS-7和AGE-1/PI3K/AKT相互作用,從而削弱了daf-16的轉(zhuǎn)錄活性。daf-2缺失株會(huì)抑制IIS信號(hào)通路,促進(jìn)daf-16的轉(zhuǎn)錄水平,從而上調(diào)一系列基因的表達(dá),促進(jìn)滯育期的形成,延長(zhǎng)壽命、促進(jìn)代謝、提高應(yīng)激反應(yīng)、天然免疫能力等,daf-2活力的下降可以延長(zhǎng)線蟲的壽命達(dá)一倍[16]。IIS與哺乳動(dòng)物中的胰島素信號(hào)通路有著高度的相似性,利用秀麗線蟲研究該通路在調(diào)節(jié)碳水化合物代謝以及衰老的機(jī)制成為近年來科學(xué)家們關(guān)注的熱點(diǎn)。

本文通過探究芫荽不同部位水提物處理后的秀麗隱桿線蟲體內(nèi)活性氧水平、急性氧損傷的保護(hù)作用來評(píng)價(jià)芫荽的體內(nèi)抗氧化活性,同時(shí)還從基因水平上初步探究芫荽不同部位水提物抗氧化作用發(fā)生機(jī)制,以期進(jìn)一步為芫荽的抗氧化活性研究和開發(fā)其價(jià)值提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

芫荽成熟后期的籽實(shí)和莖葉 江蘇南京高淳地區(qū),經(jīng)南京野生植物綜合利用研究院肖正春教授鑒定為傘形科芫荽屬CoriandrumsativumL.;N2野生型秀麗隱桿線蟲、OP50(尿嘧啶滲漏突變型)大腸桿菌 由東南大學(xué)惠贈(zèng);百草枯 美國Sigma公司;ROS活性氧測(cè)定試劑盒 南京建成生物工程研究所;總RNA提取試劑盒、cDNA合成試劑盒、SYBR Premix EX Taq(Tli RnaseH Plus)試劑盒 Takara試劑有限公司;其余試劑 均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

FW-100高速萬能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司;JCS-600型電子天平 凱豐集團(tuán)有限公司;T6紫外/可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮儀器廠;循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州天瑞儀器有限公司;奧林巴斯顯微鏡(Olympus_BX41) 奧林巴斯(中國)有限公司;HCB-1300V潔凈工作臺(tái) 青島海爾特種電器有限公司;JW-2017HR高速冷凍離心機(jī) 安徽嘉文儀器裝備有限公司;SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;MG96+PCR儀 杭州朗基科學(xué)儀器有限公司;Biosens SC810凝膠成像系統(tǒng) 上海山富科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 芫荽提取物制備 提取方法參考文獻(xiàn)[17-18],芫荽籽和莖葉洗凈,置于常溫中自然晾干。粉碎芫荽籽和莖葉后過40目篩,分別以蒸餾水煮籽粉末和莖葉,料液比為1∶10 g/mL,煮沸水提3 h,過濾后得濾液,再經(jīng)減壓濃縮、干燥得各自水提物浸膏。以蒸餾水復(fù)配得水提液備用。

1.2.2 NGM培養(yǎng)基的配制 在975 mL蒸餾水中分別加入3 g氯化鈉、2.5 g多聚蛋白胨和17 g瓊脂粉,高壓蒸汽滅菌,取出后放置于超凈工作臺(tái)中,向溶液中分別加入1 mL 1 mol/L氯化鈣溶液、1 mL 1 mol/L硫酸鎂溶液以及25 mL 0.1 mol/L磷酸鉀溶液,混勻,待溶液冷卻至50 ℃時(shí)再加入1 mL 5 mg/L膽固醇,搖晃均勻后倒入無菌培養(yǎng)皿中,備用。

1.2.3 秀麗隱桿線蟲同步化處理 同步化方法參考文獻(xiàn)[19],以LB液體培養(yǎng)基活化OP50大腸桿菌,然后將108CFU/mL菌液以1/2培養(yǎng)皿半徑于培養(yǎng)基中心處涂布畫圓,在超凈工作臺(tái)內(nèi)自然風(fēng)干后使用。正常培養(yǎng)的線蟲在成蟲后通過顯微鏡觀察可見其體內(nèi)的蟲卵,當(dāng)一塊培養(yǎng)基上大多數(shù)線蟲體內(nèi)有蟲卵時(shí)可進(jìn)行同步化。用M9緩沖液將線蟲沖洗收集至無菌EP管中,待蟲體沉降至管底時(shí)加入緩沖液反復(fù)洗滌至溶液無明顯渾濁,去上清,再加入1 mL裂解液(1 mol/L NaOH與2.5%(V/V)NaClO等比混合,現(xiàn)配現(xiàn)用),立即混勻,上下倒顛5 min后4000 r/min離心1 min,留沉淀,加入M9緩沖液,再離心,重復(fù)3次,最后把沉淀移至新的NGM培養(yǎng)基上,20 ℃培養(yǎng)48 h后得L4期線蟲。

1.2.4 秀麗隱桿線蟲暴露方法 分別制備芫荽籽和莖葉水提物溶液,設(shè)置濃度為0.1、1、10 mg/mL。取同步化后L4期成蟲分別以不同濃度的兩種水提物溶液處理線蟲24 h后,分別將其以M9緩沖液沖洗收集在無菌EP管中,反復(fù)洗滌直至上清液無渾濁。

1.2.5 體內(nèi)ROS活性氧水平 取同步化并暴露過的線蟲,按照ROS活性氧試劑盒操作說明配試劑、處理線蟲4 h后,用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察線蟲體內(nèi)產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度,并拍照記錄,激發(fā)波長(zhǎng)488 nm,測(cè)量波長(zhǎng)510 nm。

1.2.6 百草枯急性氧損傷實(shí)驗(yàn) 不同濃度芫荽水提物暴露后的線蟲去除上清液,放入96孔板中每孔10條,分別加入40 μL 100 mmol/L百草枯溶液,20 ℃環(huán)境下處理6 h后計(jì)數(shù)每孔中存活著的線蟲個(gè)數(shù),各濃度三個(gè)平行,實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次,計(jì)算存活率,取平均值[20]。

存活率(%)=存活條數(shù)/總條數(shù)×100

1.2.7 逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)定量PCR

1.2.7.1 引物設(shè)計(jì) 參照Wormbase上線蟲胰島素信號(hào)通路上的基因序列,使用Primer軟件設(shè)計(jì)了actin-1、daf-2和daf-16三個(gè)基因的引物特異性序列,其中actin-1為管家基因。daf-2作為胰島素受體同源物定位于細(xì)胞膜上,是線蟲中表達(dá)胰島素受體家族的唯一成員,與細(xì)胞胞外類似胰島素配體結(jié)合后,會(huì)使得一系列信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生,最終通過磷酸化daf-16達(dá)到抑制其進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能,從而延長(zhǎng)動(dòng)物的壽命。引物序列具體見表1。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物序列

1.2.7.2 總RNA提取 按照試劑盒說明稱取1.2.4暴露處理后的10 mg/mL秀麗隱桿線蟲若干,以M9緩沖液處理后的線蟲為空白對(duì)照,提取的總RNA以RNase Free蒸餾水溶解,提取的RNA純度和濃度根據(jù)OD260/280比值判斷。

1.2.7.3 cDNA合成及實(shí)時(shí)定量PCR 取1.2.7.2實(shí)驗(yàn)所得總RNA提取液,按照試劑盒說明在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行冰上操作,所需用具均需要經(jīng)過滅菌處理。cDNA合成具體反應(yīng)體系如表2,實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系具體如表3,基因最終表達(dá)結(jié)果以目標(biāo)基因與管家基因的比值來表示。反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)的程序設(shè)計(jì)為:按照12.5 μL中625 ng總RNA,40 mol/L逆轉(zhuǎn)錄引物,4000 mol/L Tris-HCl,6000 mol/L KCl,240 mol/L MgCl2,800 mol/L二硫蘇糖醇,20 U RNA酶抑制劑和100 U逆轉(zhuǎn)錄酶混合,在25 ℃孵育5 min和42 ℃孵育60 min后,逆轉(zhuǎn)錄酶滅活70 ℃ 15 min,-20 ℃保存?zhèn)溆?。按照cDNA 1 μL,SYBR Green I Master Mix 8 μL,SYBR Green I Master Plus 2 μL,forward primer 1.2 μL,reserse primer 1.2 μL,H2O 6.6 μL的構(gòu)成配成20 μL體系,ABI 7500實(shí)時(shí)PCR儀上94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃ 30 s,特定溫度退火30 s,72 ℃延伸30 s并采集熒光信號(hào),共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。以比較域值法測(cè)定目的基因相對(duì)表達(dá)水平,以內(nèi)參(act-1)做均一化處理,實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的ΔCt=Ct目的-Ct內(nèi)參,表示目的基因相當(dāng)于內(nèi)參表達(dá)的比例;ΔΔCt=ΔCt暴露組-ΔCt對(duì)照組,以2-ΔΔCt±S.D可反映劑量組與對(duì)照組目的基因表達(dá)的差異(倍數(shù))。

表2 cDNA反應(yīng)體系

表3 實(shí)時(shí)定量PCR

1.3 數(shù)據(jù)處理

熒光強(qiáng)度分析使用Image J圖像軟件,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0軟件處理并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)方差分析,顯著水平0.05與0.01代表統(tǒng)計(jì)分析上的顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 秀麗隱桿線蟲體內(nèi)ROS水平

ROS與各種疾病,包括急性中毒、心血管疾病、炎癥、各種病毒性損傷、藥物性組織損傷、高血壓等的病理過程以及衰老的生理變化密切相關(guān)。過量的ROS會(huì)破壞機(jī)體氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)的平衡狀態(tài),導(dǎo)致組織細(xì)胞脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)損傷、DNA斷裂等,需要使用抗氧化劑和自由基清除劑來減輕或阻止機(jī)體損傷。DCFH-DA(2,7-dichlorofuorescin diacetate)是迄今最常用、最靈敏的細(xì)胞內(nèi)活性氧檢測(cè)探針。進(jìn)入細(xì)胞后DCFH-DA被酯酶水解為DCFH,活性氧會(huì)將其氧化為DCF,這是一種不能透過細(xì)胞膜的強(qiáng)綠色熒光物質(zhì),其熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)活性氧水平呈正比。

如圖1所示,與空白對(duì)照組相比,經(jīng)過不同濃度的芫荽籽水提物處理后線蟲體內(nèi)熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)明顯減弱,說明線蟲體內(nèi)活性氧水平下降。隨著芫荽籽水提物濃度的逐漸增大,線蟲體內(nèi)熒光強(qiáng)度不斷下降,當(dāng)濃度達(dá)到10 mg/mL時(shí),熒光強(qiáng)度最暗,說明芫荽籽的水提物能夠有效的降低秀麗隱桿線蟲體內(nèi)ROS水平。

圖1 芫荽籽水提物對(duì)線蟲體內(nèi)活性氧水平的影響

芫荽莖葉水提物對(duì)線蟲的作用結(jié)果如圖2,與對(duì)照相比,莖葉水提物處理后的線蟲體內(nèi)熒光強(qiáng)度也發(fā)生明顯減弱的趨勢(shì),隨著濃度增加,熒光強(qiáng)度逐漸減弱,最大濃度10 mg/mL處理時(shí)熒光強(qiáng)度最弱,由此可以說明芫荽莖葉水提物也有降低線蟲體內(nèi)ROS活性氧水平的作用。

圖2 芫荽莖葉水提物對(duì)線蟲活性氧水平的影響

2.2 PQ對(duì)秀麗隱桿線蟲存活率的影響

氧化應(yīng)激是PQ損傷的主要機(jī)制,通過體外運(yùn)用具有抗氧化作用的芫荽水提物可明顯減輕PQ誘導(dǎo)的氧化損傷。由圖3可知,對(duì)照組線蟲經(jīng)PQ損傷6 h后存活率為57.78%±1.92%,而經(jīng)0.1、1、10 mg/mL的芫荽籽水提物處理后,線蟲的存活率均極顯著增加(P<0.01),分別為71.11%±1.92%、86.67%±3.33%和87.78%±6.94%,且隨著處理濃度的增加,秀麗隱桿線蟲的存活率呈正相關(guān)增長(zhǎng)趨勢(shì)。

圖3 不同濃度芫荽籽水提物對(duì)百草枯誘導(dǎo)線蟲存活率的影響

芫荽莖葉水提物處理后的線蟲見圖4,在濃度為0.1 mg/mL時(shí)存活率與對(duì)照組差異不顯著,當(dāng)濃度為1、10 mg/mL時(shí)存活率出現(xiàn)顯著上升(P<0.05),存活率最大達(dá)到78.89%±5.09%。由此可見,芫荽籽和莖葉水提物在PQ損傷中均能夠發(fā)揮保護(hù)作用,其中芫荽籽水提物效果更佳,在較低濃度下(0.1 mg/mL)就能起防護(hù)功效。

圖4 不同濃度芫荽莖葉水提物對(duì)百草枯誘導(dǎo)線蟲存活率的影響

2.3 秀麗隱桿線蟲體內(nèi)胰島素信號(hào)途徑抗氧化基因的表達(dá)

秀麗隱桿線蟲生理指標(biāo)的影響與胰島素/IGF-1(IIS)信號(hào)通路密切相關(guān)[21-22],IIS信號(hào)通路的減弱會(huì)導(dǎo)致線蟲壽命的延長(zhǎng)、天然免疫系統(tǒng)和氧化應(yīng)激能力的增強(qiáng),這些表型的適應(yīng)依賴于daf-16的激活,該轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)了一系列與線蟲生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)[23-25]。實(shí)驗(yàn)選用10 mg/mL芫荽水提物處理后的線蟲探究基因daf-2和daf-16是否發(fā)揮作用。

由圖5可知,經(jīng)過10 mg/mL芫荽籽和莖葉水提物處理后,線蟲中daf-2基因表達(dá)水平均極顯著降低(P<0.01),線蟲體內(nèi)氧化衰老有關(guān)的IIS信號(hào)通路daf-2表達(dá)下調(diào),會(huì)調(diào)控daf-16基因表達(dá)表達(dá)量升高,與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果趨勢(shì)相吻合。因此,初步推測(cè)芫荽水提物在線蟲體內(nèi)表現(xiàn)出的抗氧化效果可能是daf-2和daf-16基因相互作用的結(jié)果。

圖5 芫荽水提物對(duì)胰島素信號(hào)通路目標(biāo)基因表達(dá)的影響

3 討論與結(jié)論

本文以秀麗隱桿線蟲為模型探究芫荽兩種不同部位水提物的體內(nèi)抗氧化作用。正常的生理狀態(tài)下,生物體內(nèi)ROS處于產(chǎn)生與清除的動(dòng)態(tài)平衡,適量的ROS不會(huì)對(duì)機(jī)體造成損傷,但過多的ROS就會(huì)對(duì)機(jī)體代謝產(chǎn)生干擾,引起各種慢性疾病和衰老[26]。芫荽水提物可以顯著減少線蟲體內(nèi)ROS的積累,具有良好的體內(nèi)抗氧化活性。PQ引起線蟲體內(nèi)急性氧化應(yīng)激結(jié)果表明,經(jīng)過芫荽水提物前處理的線蟲在PQ環(huán)境下的生存率明顯高于空白對(duì)照組,提高秀麗隱桿線蟲的壽命。已有報(bào)道表明芫荽提取物具有良好的體外抗氧化效果[18],本文通過體內(nèi)抗氧化生理實(shí)驗(yàn)也取得了一致的結(jié)論,由此充分證實(shí)芫荽能夠有效抵御氧化傷害。

基因daf-2和daf-16在線蟲胰島素信號(hào)途徑起著至關(guān)重要地位,對(duì)線蟲的抗衰老和延長(zhǎng)壽命發(fā)揮著關(guān)鍵作用[27]。Libina等[28]發(fā)現(xiàn)胰島素蛋白既可以使daf-16-生殖細(xì)胞缺陷型線蟲的壽命恢復(fù)到正常水平,同時(shí)還能大幅度提升daf-16-胰島素途徑線蟲突變株的壽命長(zhǎng)度,實(shí)驗(yàn)表明抑制daf-2或激活daf-16,從而平衡和調(diào)整下游基因的表達(dá)來延緩線蟲體內(nèi)衰老的速率。本實(shí)驗(yàn)探究10 mg/L芫荽水提物處理后,發(fā)現(xiàn)線蟲胰島素信號(hào)途徑中daf-2表達(dá)量的下降促進(jìn)了daf-16基因表達(dá)量的顯著提高,可推測(cè)芫荽籽和成熟莖葉水提物對(duì)線蟲的抗氧化保護(hù)作用與這兩種基因的調(diào)控表達(dá)密切相關(guān),具體作用機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。