吳熙 陳寧 秦美蓉 王曉煒 王平

【中圖分類號(hào)】R89

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】B

【文章編號(hào)】1005-0019（2020）19-218-02

歐洲替代方法驗(yàn)證中心（European Centre for the Validation of Alternative Methods， ECVAM）的創(chuàng)立是以保護(hù)動(dòng)物在試驗(yàn)和其他科學(xué)研究方面的使用為目的，發(fā)展審批有助于縮減、優(yōu)化、替代（Reduce，Refine，Replace，3Rs）動(dòng)物試驗(yàn)的替代方法[1]。EpiSkinTM測(cè)試方法作為一種全新的皮膚刺激性試驗(yàn)在2007年通過歐盟替代方法驗(yàn)證中心的驗(yàn)證（EURL ECVAM）并被OECD指導(dǎo)原則收錄。EpiSkinTM是對(duì)人天然皮膚的模擬，即將分離的人表皮細(xì)胞接種在特定的生物材料上進(jìn)行培養(yǎng)， 以形成具有三維結(jié)構(gòu)的人表皮樣皮膚模型，并具備以下特征：（1）組織學(xué)上具備人表皮樣結(jié)構(gòu)， 即有基底層、棘細(xì)胞層、顆粒細(xì)胞層和角質(zhì)層， 且角質(zhì)層具有基本的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)。（2）功能上角質(zhì)層脂質(zhì)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的屏障作用能夠在一定程度上抵擋有害物質(zhì)對(duì)下層活性細(xì)胞的毒性作用。

本實(shí)驗(yàn)采用EpiSkinTM 3D人工皮膚模型，按照歐盟OECD 439推薦使用的4種用于皮膚模型刺激性測(cè)試的化學(xué)品，同時(shí)遵循OECD 439的實(shí)驗(yàn)流程進(jìn)行皮膚模型的化妝品刺激性測(cè)試，并根據(jù)其判斷標(biāo)準(zhǔn)來預(yù)測(cè)化學(xué)品對(duì)于皮膚的刺激性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 EpiSkinTM 皮膚模型（上海斯安膚諾生物科技有限公司） EpiSkinTM 皮膚模型以正常人的角質(zhì)形成細(xì)胞為種子細(xì)胞，在體外發(fā)育成復(fù)層化結(jié)構(gòu)的表皮模型。在組織學(xué)結(jié)構(gòu)上與人皮膚結(jié)構(gòu)高度相似，含有角質(zhì)層、顆粒層、棘層和基底層，見圖1。

1.1.2 試劑 噻唑藍(lán)（MTT）（Sigma，美國）、異丙醇（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）、含鈣鎂的磷酸鹽緩沖液（DPBS）（Gibco，美國）、磷酸鹽緩沖液（PBS）（Gibco，美國）、維持培養(yǎng)基（上海斯安膚諾生物科技有限公司）、測(cè)試培養(yǎng)基（上海斯安膚諾生物科技有限公司）。

1.1.3 受試物 硬脂酸甲酯、1-甲基-3-苯基哌嗪、庚醛、兔耳草醛，十二烷基磺酸鈉（SDS）均購自Sigma公司，均為化學(xué)純?cè)噭?/p>

1.1.4 儀器設(shè)備 細(xì)胞培養(yǎng)箱、通風(fēng)柜、振蕩器、酶標(biāo)儀、電子天平、超純水機(jī)、專用打孔器、四通道計(jì)時(shí)器。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)依據(jù)及原理 該實(shí)驗(yàn)方法依據(jù)國際經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（OECD）化學(xué)品測(cè)試指南439[2]的規(guī)定進(jìn)行?；驹硎谴碳ば曰瘜W(xué)物質(zhì)作用于皮膚模型引起的刺激作用類似于細(xì)胞毒性損傷作用，通過3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（簡(jiǎn)稱MTT） 法檢測(cè)細(xì)胞活性來判斷化學(xué)物的皮膚刺激性。

1.2.2 質(zhì)量控制 EpiSkinTM3D人工皮膚模型（中國生產(chǎn)）是來源于中國人角質(zhì)形成細(xì)胞的重建人類表皮模型，通過檢測(cè)確保不攜帶HIV、乙肝和丙肝病毒、細(xì)菌和支原體。

基于質(zhì)量控制的指標(biāo)，EpiSkinTM3D人工皮膚模型可用于正式皮膚刺激性測(cè)試。對(duì)于每一種化學(xué)品，需要3輪不同批次的皮膚模型來對(duì)其進(jìn)行皮膚刺激性的測(cè)試。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

（1）在無菌培養(yǎng)板中加入維持培養(yǎng)基，用鑷子將組織移至新的培養(yǎng)板中。將培養(yǎng)板放置在37℃通有5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

（2）在培養(yǎng)板孔中加入0.3mg/mL的MTT溶液，將待測(cè)樣品（10μL或10mg）分別加入孔中，將載有MTT溶液和待測(cè)樣品的培養(yǎng)板放在37℃通有5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3h。如果MTT溶液顏色變成藍(lán)色或紫色，說明待測(cè)樣品與MTT反應(yīng)，在之后的刺激性測(cè)試中需使用死皮對(duì)照以去掉非特異性光密度值。

1.2.4 分組 實(shí)驗(yàn)設(shè)陰性對(duì)照和陽性對(duì)照。PBS為陰性對(duì)照組，5%SDS為陽性對(duì)照組，硬脂酸甲酯、1-甲基-3-苯基哌嗪、庚醛、兔耳草醛為受試物組。

1.2.5 加樣量 液體樣品每孔10μL。固體樣品每孔（10±2）mg，并加入5μL蒸餾水，使其溶解。

1.2.6 實(shí)驗(yàn)步驟

（1）化學(xué)品10 μL（固體10 mg研成粉末，同時(shí)加蒸餾水5 μL）局部接觸面積約0.37 cm2的皮膚模型表面15 min;（2）陰性對(duì)照加10 μL PBS、陽性對(duì)照加10 μL 5%SDS;（3）與化學(xué)品接觸15 min后用25 mL PBS沖洗活性皮膚，浸入2.0 mL維持培養(yǎng)基內(nèi)。1-3步需在通風(fēng)安全柜中進(jìn)行;（4）繼續(xù)在飽和濕度、5% CO2、37 ℃的條件下孵育42 h;（5）浸入2.0 mL濃度0.3 mg/mL的MTT溶液（用測(cè)試培養(yǎng)基配制）內(nèi)，在飽和濕度、5% CO2、37 ℃孵育3 h;（6）MTT反應(yīng)完的皮膚模型，浸入500 μL酸化異丙醇的離心管內(nèi)，混勻，在室溫、避光的條件下過夜;（7）振蕩混合儀混勻每個(gè)離心管，每管中取200 μL標(biāo)本加入96孔板中，在570 nm處用酶標(biāo)儀讀取光密度值，以酸化異丙醇溶液作為空白對(duì)照。按照下列公式，將所得光密度值換算為組織細(xì)胞存活率，用組織細(xì)胞存活率來判斷化學(xué)品是否具有刺激性，陰性對(duì)照的平均光密度值相當(dāng)于100%的細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率（%）=（受試物光密度值/陰性對(duì)照組光密度值）×100%

1.2.7 結(jié)果判定

根據(jù)受試物三輪試驗(yàn)測(cè)試的細(xì)胞存活率計(jì)算平均值得到該受試物的組織細(xì)胞存活率，按表1判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行刺激等級(jí)判定。

1.2.8 系統(tǒng)成立的條件 須同時(shí)滿足以下三個(gè)條件：

（1）陰性對(duì)照平均光密度值介于0.6-1.5之間，SD（%）≤18;

（2）陽性對(duì)照平均細(xì)胞存活率≤40%，SD（%）≤18;

（3）受試物的細(xì)胞存活率是通過三輪獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)（即3個(gè)不同批次）獲得的平均值，每輪實(shí)驗(yàn)每個(gè)受試物設(shè)3個(gè)皮膚模型單位進(jìn)行評(píng)價(jià)，同批次模型受試物的評(píng)價(jià)等級(jí)需一致。

2 結(jié)果

4 種化學(xué)品的細(xì)胞存活率見表1。

根據(jù)本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)所測(cè)試的4種化學(xué)品與歐洲替代方法驗(yàn)證中心（ECVAM）的化學(xué)品分類標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試結(jié)果進(jìn)行比較（這4種化學(xué)品分類標(biāo)準(zhǔn)是依據(jù)兔皮膚實(shí)驗(yàn)體內(nèi)測(cè)試），同時(shí)也與歐盟認(rèn)可皮膚模型EpiSkin在歐洲的體外測(cè)試結(jié)果比較，結(jié)果見表2。

在4種化學(xué)品中，ECVAM體內(nèi)測(cè)試分類數(shù)據(jù)表明刺激性化學(xué)品為3種，本實(shí)驗(yàn)皮膚模型能正確分類3種;非刺激性化學(xué)品為1種，本實(shí)驗(yàn)?zāi)苷_分類1種，準(zhǔn)確率達(dá)到100%。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)選擇的4種化合物各自具有典型的特點(diǎn)，物理狀態(tài)包括液態(tài)和固態(tài)。液態(tài)化合物中庚醛為易揮發(fā)物質(zhì)，而EpiSkinTM人工皮膚模型加樣量僅為10 μL，并且需涂抹20 s，環(huán)境溫度和凈化操作臺(tái)的風(fēng)向可能對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響較大，所以其數(shù)值結(jié)果較大。兔耳草醛可以與MTT相互作用影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因此需使用死皮對(duì)照以去掉非特異性光密度值。本實(shí)驗(yàn)選擇3種刺激性化合物和1種非刺激性化合物，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與ECVAM體內(nèi)測(cè)試分類數(shù)據(jù)一致，EpiSkinTM人工皮膚模型可以評(píng)估化學(xué)品的皮膚刺激性。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在研究疾病、開發(fā)檢測(cè)醫(yī)藥和疫苗、評(píng)價(jià)化學(xué)物質(zhì)的危險(xiǎn)性等諸多方面，有著不可或缺的重要作用。隨著各國有關(guān)動(dòng)物福利法律的完善，尋找替代動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的科學(xué)方法得到了各國政府和科學(xué)工作者的關(guān)注。許多發(fā)達(dá)國家廣泛開展了體外替代方法的研究和驗(yàn)證工作，已涉及到皮膚刺激和腐蝕性實(shí)驗(yàn)、眼刺激和腐蝕性實(shí)驗(yàn)、光毒性實(shí)驗(yàn)、皮膚致敏性實(shí)驗(yàn)以及熱原檢驗(yàn)等[4-6]。EpiSkinTM人工皮膚模型已經(jīng)過多個(gè)國家的實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證，并被收錄在OECD指導(dǎo)原則中，是國際上認(rèn)可的模型。

參考文獻(xiàn)

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