β-葡萄糖苷酶生物轉(zhuǎn)化刺梨槲皮素糖苷的工藝優(yōu)化

余奕宏， 顧苑婷， 丁筑紅， 陳思奇， 宋煜婷， 王 翼

(貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院/國(guó)家林業(yè)和草原局刺梨工程技術(shù)研究中心/貴州省農(nóng)畜產(chǎn)品貯藏加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽 550025)

刺梨中天然黃酮類化合物大部分是以與糖結(jié)合的黃酮糖苷的形式存在，是植物的次生代謝產(chǎn)物[1]，研究證明，黃酮結(jié)合型糖苷藥物活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于游離的苷元，通過去糖基定向修飾黃酮類化合物的分子結(jié)構(gòu)可以發(fā)揮其特定功能[2]。生物轉(zhuǎn)化去糖基是最經(jīng)濟(jì)綠色的途徑，目前利用最多的為β-葡萄糖苷酶[3]，但是不同來源的β-葡萄糖苷酶對(duì)底物水解的酶性能相差很大且安全性存疑[4-5]。因此，選擇合適來源的β-葡萄糖苷酶和提升其對(duì)黃酮類化合物的水解效果成為研究的重點(diǎn)。刺梨中黃酮類物質(zhì)作為其重要的活性成分[6]，目前研究缺乏系統(tǒng)和深度，相關(guān)報(bào)道僅限于黃酮含量及檢測(cè)方法、提取技術(shù)及黃酮粗提物功能評(píng)價(jià)[7-8]等，對(duì)刺梨黃酮類化合物的生物轉(zhuǎn)化方面未見報(bào)道。

目前報(bào)道較多的常用于食品的β-葡萄糖苷酶主要來源于杏仁[9]、木霉(Trichoderma)[10]和乳酸菌(Lactobacillus)[11]。本項(xiàng)目組前期研究發(fā)現(xiàn)，嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus) GIM1.208β-葡萄糖苷酶釋放刺梨槲皮素(Que2)含量為處理前原料的5.42倍。因此本實(shí)驗(yàn)通過分析木霉、杏仁及嗜酸乳桿菌3種來源的β-葡萄糖苷酶酶解刺梨槲皮素-3-O-蕓香糖苷(Rut)、槲皮素-3-O-鼠李糖苷(Que)和槲皮素-3-O-葡萄糖苷(Iso)的黃酮苷元特性及酶解條件，篩選較優(yōu)β-葡萄糖苷酶，探討提高刺梨黃酮苷元釋放能力的生物轉(zhuǎn)化途徑，以期為刺梨黃酮的研究開發(fā)提供理論基礎(chǔ)，為藥物和功能食品提供豐富的資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

刺梨：貴農(nóng)5號(hào)種植品種，摘于貴州省龍里縣，新鮮潔凈，大小均勻無霉?fàn)€，密封裝袋后凍藏于-20 ℃的冰箱備用。

試劑：槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品、槲皮素-3-O-鼠李糖苷標(biāo)準(zhǔn)品、槲皮素-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品、槲皮素-3-O-蕓香糖苷標(biāo)準(zhǔn)品，純度均大于等于98.0%，上海源葉生物科技有限公司；對(duì)硝基苯酚，南京大唐化工有限責(zé)任公司；對(duì)硝基苯酚-β-D葡萄糖苷(p-NPG)、杏仁β-葡萄糖苷酶，美國(guó)Sigma公司；嗜酸乳桿菌GIM.1.208，貴州輕化工中心；木霉β-葡萄糖苷酶(Trichodermaβ-glucosidase)，江蘇銳陽生物科技有限公司；無水乙醇、磷酸，均為分析純，濟(jì)南明星化工有限公司；甲醇、乙腈，均為色譜純，美國(guó)Tedia公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

1260型高效液相色譜儀(配有DAD檢測(cè)器/紫外-熒光檢測(cè)器)，美國(guó)Agilent公司；SpectraMAX190型光吸收酶標(biāo)儀 ，美谷分子儀器(上海)有限公司；TGL20M型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，諸城鼎力機(jī)械有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1液相色譜條件

參考文獻(xiàn)[12]，色譜柱為ACI C18(250 mm×4.6 mm)，流動(dòng)相為乙腈-0.4%磷酸水溶液(體積比28∶72)，流速1.0 mL/min，柱溫25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm，進(jìn)樣量10 μL。

1.3.2酶比活力的測(cè)定

酶比活力的測(cè)定采用丁小娟等[13]的方法，即以p-NPG為底物,在β-葡萄糖苷酶作用下水解成p-NP(對(duì)硝基苯酚)和葡萄糖,利用p-NP在堿性條件下顯色的原理，測(cè)定β-葡萄糖苷酶的酶活力。1 mL酶液1 min酶解1 μmolp-NPG產(chǎn)生1 μmolp-NP所需的酶量，定義為一個(gè)酶活力單位，以U/mL表示。

1.3.3菌種活化培養(yǎng)基配制

MRS培養(yǎng)基：參照丁小娟等[13]配制方法。

菌種活化：MRS活化培養(yǎng)液121 ℃，0.1 MPa滅菌30 min，接入嗜酸乳桿菌GIM.1.208，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h備用。

1.3.4標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取槲皮素4.5 mg，槲皮素-3-O-蕓香糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-鼠李糖苷標(biāo)準(zhǔn)品各5.0 mg加甲醇溶解，于25 mL容量瓶中定容，得到質(zhì)量濃度分別為0.18、0.20、0.20、0.20 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，分別吸取0、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 mL定容至20 mL容量瓶中，進(jìn)行HPLC分析。以HPLC測(cè)得的峰面積為y軸，標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為x軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5樣品溶液的制備

將刺梨真空冷凍干燥后粉碎，得刺梨干粉備用。稱取適量刺梨粉于錐形瓶中按液料比20∶1 (mL/g)加入體積分?jǐn)?shù)70%乙醇，300 W、50 ℃條件下超聲40 min，石油醚去除脂溶性色素，4 000 r/min 離心5～10 min，收集上清液濃縮，加入預(yù)處理好的HPD600樹脂層析柱上進(jìn)行純化富集，吸附飽和后，用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇洗脫，收集洗脫液，制得純化樣品溶液，滅活內(nèi)源酶?jìng)溆谩?/p>

1.3.6不同來源β-葡萄糖苷酶對(duì)槲皮素糖苷轉(zhuǎn)化率的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[12]適當(dāng)修改。以不加任何酶的體系為空白組，其他實(shí)驗(yàn)組分別加入1 U/mL的3種β-葡萄糖苷酶[14]。反應(yīng)體系200 μL，包含樣品液20 μL、磷酸鈉緩沖溶液(pH值5，50 mmol/L)120 μL、酶液60 μL。在50 ℃，pH值5的條件下分別反應(yīng)10、20、30、40、50、60 min，反應(yīng)完成后冰浴3 min終止反應(yīng)，加入等體積甲醇，樣品經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，取10 μL進(jìn)行HPLC檢測(cè)，根據(jù)式(1)，計(jì)算各β-葡萄糖苷酶酶解槲皮素糖苷的轉(zhuǎn)化率。

(1)

式(1)中：ρ為酶解前槲皮素糖苷質(zhì)量濃度，μg/mL，ρ0為酶解后剩余糖苷質(zhì)量濃度，μg/mL。

1.3.7杏仁β-葡萄糖苷酶水解槲皮素糖苷單因素實(shí)驗(yàn)

反應(yīng)體系200 μL：樣品液20 μL、磷酸鈉緩沖溶液(pH值5，50 mmol/L)120 μL、酶液60 μL。分別考察酶解時(shí)間(10、20、30、40、50、60 min)、酶解pH值(4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)、酶解溫度(30、35、40、45、50、55、60 ℃)、酶用量(酶與底物質(zhì)量比)(0.030%、0.040%、0.050%、0.075%、0.100%、0.200%)對(duì)糖苷轉(zhuǎn)化率的影響，反應(yīng)完成后冰浴3 min終止反應(yīng)，加入等體積甲醇，樣品經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，取10 μL進(jìn)行HPLC檢測(cè)[12,15]。

1.3.8響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在最優(yōu)來源的杏仁β-葡萄糖苷酶水解條件單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，進(jìn)行 Box-Behnken 試驗(yàn)，以槲皮素-3-O-蕓香糖苷轉(zhuǎn)化率(Y1)、槲皮素-3-O-鼠李糖苷轉(zhuǎn)化率(Y2)、槲皮素-3-O-葡萄糖苷轉(zhuǎn)化率(Y3)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行四因素三水平Box-Behnken試驗(yàn)，因素與水平見表1。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行顯著性分析，Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)方案，建立數(shù)學(xué)模型并進(jìn)行多元回歸分析，

Origin 8.0軟件制圖。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

回歸方程與線性范圍見表2，考察結(jié)果證明3種糖苷在0.01～0.20 mg/mL線性良好，槲皮素在0.004 5～0.144 0 mg/mL線性良好，可為后續(xù)樣品含量測(cè)定提供可靠依據(jù)。

表2 不同黃酮化合物的回歸方程

2.2 不同來源β-葡萄糖苷酶對(duì)刺梨槲皮素糖苷的酶解效果

2.2.1β-葡萄糖苷酶對(duì)槲皮素糖苷轉(zhuǎn)化率的影響

圖1 不同來源β-葡萄糖苷酶對(duì)槲皮素糖苷轉(zhuǎn)化率的影響Fig.1 Effect of β-glucosidase from different sources on conversion rate of quercetin glycosides

β-葡萄糖苷酶通過斷裂槲皮素糖苷化合物之間的糖苷鍵來完成對(duì)底物的水解，不同來源的β-葡萄糖苷酶結(jié)構(gòu)與組成不同，糖基化程度、糖鏈聚合度、糖鏈分支與相對(duì)分子質(zhì)量差異較大，一級(jí)結(jié)構(gòu)、活性區(qū)域氨基酸序列中心基團(tuán)以及具催化作用的氨基酸殘基排列及狀態(tài)不同[16]，從而導(dǎo)致它們對(duì)不同底物親和力及水解機(jī)制存在差異。3種來源的β-葡萄糖苷酶對(duì)槲皮素糖苷轉(zhuǎn)化率的影響見圖1。由圖1可以看出，反應(yīng)60 min時(shí)，3種β-葡萄糖苷酶對(duì)槲皮素-3-O-葡萄糖苷的轉(zhuǎn)化率均為最高，分別為74.10%、70.50%、62.50%。β-葡萄糖苷酶水解槲皮素糖苷鍵的能力取決于糖基[17]，槲皮素苷元的糖基不同對(duì)酶的水解效率影響顯著[18]，且雙糖苷的轉(zhuǎn)換速率比單糖苷慢。槲皮素-3-O-葡萄糖苷只有一個(gè)葡萄糖基，在葡萄糖基的特定位點(diǎn)處的羥基可以形成額外的氫鍵，增強(qiáng)酶與底物的作用[19]，因而β-葡萄糖苷酶對(duì)槲皮素-3-O-葡萄糖苷水解轉(zhuǎn)化率最高。

2.2.2β-葡萄糖苷酶對(duì)槲皮素含量的影響

圖2 不同來源β-葡萄糖苷酶對(duì)槲皮素含量的影響Fig.2 Effect of β-glucosidase from different sources on quercetin content

不同來源β-葡萄糖苷酶對(duì)槲皮素含量的影響見圖2。由于β-葡萄糖苷酶的種類眾多，其苷元結(jié)合位點(diǎn)處的氨基酸殘基呈現(xiàn)多樣性，活性位點(diǎn)外的部分氨基酸也能通過非共價(jià)作用影響活性中心的氨基酸對(duì)底物的專一性[20]。此外，β-葡萄糖苷酶催化活性中心結(jié)構(gòu)以及氨基酸活性位點(diǎn)位置不同導(dǎo)致表面電勢(shì)差異，因此，β-葡萄糖苷酶與構(gòu)成苷元結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸殘基及與活性中心以外的氨基酸殘基的作用機(jī)制存在差異[21]，使不同β-葡萄糖苷酶具有不同的底物結(jié)合及催化作用模式。由圖2可以直觀地看出各來源的β-葡萄糖苷酶對(duì)槲皮素糖苷的整體轉(zhuǎn)化程度。由杏仁β-葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)化所得槲皮素含量一直最高，反應(yīng)30 min時(shí)含量達(dá)到152.60 μg/mL。水解作用較優(yōu)的杏仁β-葡萄糖苷酶對(duì)不同底物的轉(zhuǎn)化率由高到低依次為槲皮素-3-O-葡萄糖苷(74.10%)、槲皮素-3-O-蕓香糖苷(64.30%)、槲皮素-3-O-鼠李糖苷(31.80%)，因此，杏仁β-葡萄糖苷酶為較優(yōu)水解酶，槲皮素-3-O-葡萄糖苷為較佳酶解底物。

2.3 酶解條件對(duì)杏仁β-葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)化槲皮素糖苷的影響

2.3.1酶解pH值的影響

pH值對(duì)酶解反應(yīng)的影響見圖3。由圖3可知，隨著體系pH值增加，槲皮素糖苷轉(zhuǎn)化率上升顯著，在pH值5.0時(shí)達(dá)到最高；當(dāng)體系pH值大于5.0時(shí)，糖苷轉(zhuǎn)化率快速下降。pH值是影響β-葡萄糖苷酶活性的重要因素，酶的兩端具有游離的氨基和羧基，對(duì)pH值極為敏感，反應(yīng)體系過酸或過堿都會(huì)使酶的活性架構(gòu)解離受到影響[26]，降低底物與酶的結(jié)合程度。因此，選擇pH值5.0為優(yōu)化的酶解pH值。

圖3 酶解pH值對(duì)槲皮素糖苷含量及轉(zhuǎn)化率的影響Fig.3 Effect of hydrolysis pH on content and conversion rate of quercetin glycoside

2.3.2酶解溫度的影響

圖4 酶解溫度對(duì)槲皮素糖苷含量及轉(zhuǎn)化率的影響Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on content and conversion rate of quercetin glycoside

酶解溫度對(duì)酶解反應(yīng)的影響見圖4。由圖4可知，隨酶解溫度的升高，糖苷轉(zhuǎn)化率先升高后下降。當(dāng)溫度達(dá)到45 ℃時(shí)，槲皮素-3-O-葡萄糖苷轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高；當(dāng)溫度為50 ℃時(shí)，槲皮素-3-O-蕓香糖苷與槲皮素-3-O-鼠李糖苷轉(zhuǎn)化率最高，且此時(shí)槲皮素含量最大，所以溫度選擇50 ℃為宜。由于低溫影響分子運(yùn)動(dòng)的能量，在低溫時(shí)，酶活化分子少活性低，槲皮素糖苷分子與酶分子活性部位接觸較少導(dǎo)致反應(yīng)速率慢。溫度的升高使得酶分子運(yùn)動(dòng)加速，酶解反應(yīng)進(jìn)行較快；但隨著溫度的增加，穩(wěn)定酶的共價(jià)鍵也逐漸被消除，酶部分展開變得松弛[22]，溫度過高導(dǎo)致維持酶分子結(jié)構(gòu)的次級(jí)鍵解體[22]，蛋白質(zhì)核心的疏水性殘基暴露在溶劑中，使得蛋白質(zhì)聚集，造成酶不可逆地解構(gòu)變性失活[23]，酶解反應(yīng)被抑制。

2.3.3酶用量的影響

圖5 酶用量對(duì)槲皮素糖苷含量及轉(zhuǎn)化率的影響Fig.5 Effect of enzyme dosage on content and conversion rate of quercetin glycoside

酶用量對(duì)酶解反應(yīng)的影響見圖5。由圖5可知，隨著酶用量的增加，糖苷轉(zhuǎn)化率隨之不斷升高；當(dāng)酶用量達(dá)到0.075%后，增加酶用量，轉(zhuǎn)化率基本保持不變，選擇酶用量0.075%為宜。當(dāng)酶用量較小時(shí)，糖苷底物充足，隨著酶用量的增加，酶與底物結(jié)合程度增強(qiáng)，酶促反應(yīng)速度與底物濃度成正比[24]，轉(zhuǎn)化率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；當(dāng)酶與底物質(zhì)量比達(dá)到一定比例，糖苷底物分子結(jié)合點(diǎn)飽和，抑制酶解[22]，繼續(xù)增大酶用量不會(huì)使轉(zhuǎn)化率顯著提高。

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)分析

2.4.1響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

杏仁β-葡萄糖苷酶酶解條件響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表3，方差分析見表4至表6。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表4 槲皮素-3-O-蕓香糖苷方差分析及顯著性結(jié)果

通過軟件對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，得到槲皮素糖苷轉(zhuǎn)化率回歸方程：

表5 槲皮素-3-O-鼠李糖苷方差分析及顯著性結(jié)果

表6 槲皮素-3-O-葡萄糖苷方差分析及顯著性結(jié)果

2.4.2響應(yīng)面分析與驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

各因素交互作用對(duì)槲皮素糖苷轉(zhuǎn)化率的影響如圖6至圖8。從圖6(a)、圖6(b)可以看出，酶解時(shí)間和酶解溫度交互作用顯著，酶解溫度和酶用量交互作用極顯著，表現(xiàn)為等高線密集，響應(yīng)面曲面陡峭。表明β-葡萄糖苷酶酶解槲皮素-3-O-蕓香糖苷時(shí)對(duì)溫度敏感，同時(shí)也受酶解時(shí)間、酶用量的影響。同理，從圖7(a)、圖7(b)可以看出，酶解時(shí)間和酶用量交互作用顯著，酶解pH值和酶用量交互極顯著，表明β-葡萄糖苷酶酶解槲皮素-3-O-鼠李糖苷時(shí)對(duì)酶用量較敏感，同時(shí)也受酶解時(shí)間、酶解pH值的影響。從圖8(a)、圖8(b)可以看出，酶解時(shí)間和酶用量交互作用極顯著，酶解溫度和酶用量交互顯著，表明β-葡萄糖苷酶酶解槲皮素-3-O-葡萄糖苷時(shí)對(duì)酶用量較敏感，同時(shí)也受酶解時(shí)間、酶解溫度的影響。

圖6 各因素交互作用對(duì)槲皮素-3-O-蕓香糖苷轉(zhuǎn)化率的影響Fig.6 Effect of interaction of various factors on quercetin-3-O-rutinoside conversion rate

根據(jù)響應(yīng)面計(jì)算得到各因素優(yōu)化酶解條件為酶解時(shí)間28.91 min、酶解pH值4.9、酶解溫度51.55 ℃、酶用量0.08%，通過方程得到糖苷轉(zhuǎn)化率預(yù)測(cè)值為槲皮素-3-O-蕓香糖苷72.52%，槲皮素-3-O-鼠李糖苷37.10%，槲皮素-3-O-葡萄糖苷78.40%?？紤]實(shí)際操作修正實(shí)驗(yàn)條件為酶解時(shí)間28.90 min、酶解pH值4.9、酶解溫度52 ℃、酶用量0.08%，此條件下對(duì)酶解工藝進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，得到槲皮素-3-O-蕓香糖苷轉(zhuǎn)化率為71.48%，RSD=0.49%；槲皮素-3-O-鼠李糖苷轉(zhuǎn)化率36.32%，RSD=1.67%；槲皮素-3-O-葡萄糖苷轉(zhuǎn)化率77.86%，RSD=0.35%。槲皮素糖苷實(shí)際平均轉(zhuǎn)化率分別達(dá)到理論預(yù)測(cè)值的98.57%、97.90%、99.31%，實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值吻合較好，模型擬合度達(dá)到98.4%，說明該模型可以用來優(yōu)化杏仁β-葡萄糖苷酶水解3種槲皮素糖苷實(shí)驗(yàn)。

3 結(jié) 論

通過利用HPLC對(duì)糖苷轉(zhuǎn)化率及槲皮素含量進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，根據(jù)3種糖苷轉(zhuǎn)化所得槲皮素含量對(duì)比得出杏仁β-葡萄糖苷酶為最優(yōu)水解酶，槲皮素-3-O-葡萄糖苷為最佳水解底物。

圖7 各因素交互作用對(duì)槲皮素-3-O-鼠李糖苷轉(zhuǎn)化率的影響Fig.7 Effect of interaction of various factors on quercetin-3-O-rhamnoside

圖8 各因素交互作用對(duì)槲皮素-3-O-葡萄糖苷化率的影響Fig.8 Effect of interaction of various factors on quercetin-3-O-glucoside conversion rate

利用Box-Behnken 中心組合方法對(duì)杏仁β-葡萄糖苷酶水解3種糖苷進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定了優(yōu)化酶解工藝：酶解時(shí)間28.90 min，酶解pH值4.9，酶解溫度52 ℃，酶用量0.08%，此條件下得到槲皮素-3-O-蕓香糖苷轉(zhuǎn)化率為71.48%，槲皮素-3-O-鼠李糖苷轉(zhuǎn)化率36.32%，槲皮素-3-O-葡萄糖苷轉(zhuǎn)化率77.86%。