張程鵬 申元英

摘 要：四環(huán)素作為藥物和促生長劑，是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和畜牧業(yè)中最常用的抗生素之一。然而，不規(guī)范的抗生素濫用造成了大量抗生素抗性基因（Antibiotic resistance genes，ARGs）的形成，使得藥物治療效益顯著下降，對人類健康也產(chǎn)生了巨大威脅。目前已發(fā)現(xiàn)的四環(huán)素類抗性基因（Tet-R）的種類有40種以上，在各地豬肉生產(chǎn)鏈的各個環(huán)節(jié)中均有不同程度的檢出，Tet-R的分布存在一定的空間分布特征和時間分布特征。目前分子生物學方法因在檢測抗生素耐藥性（antimicrobial resistance，AMR）的潛在遺傳機制方面具有較高的速度和準確性而被廣泛應用。文中結合國內(nèi)外文獻，主要介紹了豬肉生產(chǎn)鏈中豬肉及生產(chǎn)廢棄物中ARGs的分布特征、研究方法等研究進展，為相關政策的制定提供科學理論依據(jù)，為養(yǎng)殖業(yè)獸醫(yī)用藥抗生素耐藥性風險評估提供一定支持。

關鍵詞：四環(huán)素;抗性基因;分布特征;檢測方法;豬肉生產(chǎn)鏈

抗生素在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和畜牧養(yǎng)殖上的應用極為廣泛。我國是抗生素生產(chǎn)和使用大國。據(jù)統(tǒng)計，我國一年生產(chǎn)抗生素21萬噸，其中有40%左右被用于禽畜養(yǎng)殖業(yè)[1]，尤其在雞、鴨、豬的養(yǎng)殖中使用更為嚴重。四環(huán)素作為一種廣譜抗生素廣泛用于禽畜養(yǎng)殖業(yè)，用以預防和治療動物疾病及促生長[2]。而抗生素大多未能被充分吸收，抗生素的濫用和對四環(huán)素污染處理工藝的缺乏使得環(huán)境中的抗生素殘留濃度增加。殘留的抗生素含量最高可達到mg/kg級水平。如：豬糞中檢出四環(huán)素類藥物的濃度高達59.06 mg/kg[3]。自然環(huán)境中的微生物種類、數(shù)量眾多，環(huán)境中抗生素殘留的增多大大增加了致病菌或條件致病菌獲得抗生素抗性的機會，產(chǎn)生大量的抗性基因。

基因是遺傳信息的載體，抗生素抗性基因（Antibiotic resistance genes， ARGs）即具有抗性的遺傳因子[4]，其賦予攜帶該基因的生物體以對抗生素的抗性。耐藥基因有可能會通過直接接觸或沿著食物鏈的污染等多種途徑進入到動物體內(nèi)，提高致病菌的抗生素抗藥性，使得細菌感染性疾病的治療難度更大，導致大量攜帶有ARGs的微生物出現(xiàn)，最終結果便是抗生素治療效力的日益下降。目前已發(fā)現(xiàn)的四環(huán)素類抗性基因（Tet-R）的種類達到40種以上?？剐曰蚴强剐跃哂锌剐缘闹饕蛑?，抗生素抗性細菌對抗生素的耐藥機理包括：細菌外膜不滲透性障礙、細菌外排泵系統(tǒng)、抗生素作用的靶位變化和抗生素的鈍化失活等[5]。它可以通過多種形式的可移動遺傳原件如質(zhì)粒、整合子、轉(zhuǎn)座子等通過基因水平轉(zhuǎn)移機制（horizontal gene transfer，HGT）在微生物間、微生物與自然環(huán)境間轉(zhuǎn)移傳播[6]。

2014年，世界衛(wèi)生組織發(fā)布的《全球抗生素耐藥報告》明確指出抗生素抗性是21世紀公共衛(wèi)生的嚴峻挑戰(zhàn)，針對動物生產(chǎn)應監(jiān)督和促進畜禽業(yè)的合理用藥，并強調(diào)了食用動物的抗生素抗性及其在食物鏈的傳播方面的數(shù)據(jù)缺乏，應加強此方面的研究[7]。我國目前正大力推行生豬養(yǎng)殖屠宰定點化，廢水的生物處理、農(nóng)田利用等公益模式。本研究通過查閱國內(nèi)外文獻，總結歸納了豬肉生產(chǎn)鏈中生豬養(yǎng)殖、屠宰、上市等環(huán)節(jié)中的豬肉、環(huán)境以及廢棄物中四環(huán)素抗性基因污染情況，以期讓更多人對生豬生產(chǎn)鏈中抗生素耐藥性問題有更深入的認識，為養(yǎng)殖業(yè)抗生素耐藥性風險評估提供一定的支持。

1 生豬生產(chǎn)鏈中四環(huán)素抗性基因分布情況

目前畜禽養(yǎng)殖業(yè)耐藥菌的研究主要是與動物傳染性疾病及人畜健康關系密切的病原菌。許多研究發(fā)現(xiàn)，生豬生產(chǎn)鏈中Tet-R的分布存在空間差異性和時間差異性。例如：Christina[8]等通過熒光定量PCR（q-PCR）對生產(chǎn)鏈中的豬肉進行檢測，發(fā)現(xiàn)零售環(huán)節(jié)（5.58 log copies）的豬肉較屠宰場環(huán)節(jié)（2.38 log copies）的豬肉tet（M）濃度顯著升高，且存在實質(zhì)性差異。作者認為腸球菌應該是可能的病原體及tet（M）潛在受體，其他一些多見于革蘭氏陰性菌群的抗性基因或在革蘭氏陽性與革蘭氏陰性菌之間有更高可交換程度的抗性基因，可能在生產(chǎn)鏈中會顯示出相似的積累。Guillermo[9]等人利用宏基因組DNA序列的方法在生豬屠宰的“麻醉區(qū)”“動物到達區(qū)”均檢測到了Tet-R，比如tet（B）、tet（Q）和tet（X）。Looft[10]等人的研究有類似的發(fā)現(xiàn)，雖在檢出的35～62個ARGs中Tet-R僅有1～4個，但這可以用“豬腸道微生物受到多重抗生素的選擇壓力，對抗生素壓力的抗性是由通用的外排泵機制而非特定的抗性基因驅(qū)動的”這一理論來解釋。王學君[11]等人研究了從貴州省8個地區(qū)規(guī)?；B(yǎng)殖場分離的豬源大腸桿菌，發(fā)現(xiàn)其攜帶的四環(huán)素耐藥基因的檢出率為（41.50%～92.60%）。孟赫誠[12]等對生豬肉加工廠食品接觸面進行Tet-R檢測，存在9種四環(huán)素耐藥基因，其中tet（L）的檢出率最高，為7.7%，其次為tet（A）（6.0%）、tet（B）（4.8%）、tet（C）（4.8%）、tet（E）（3.6%）、tet（M）（3.6%）、tet（S）（3.6%）、tet（K）（1.2%）和tet（X）（0.6%）。所有分離菌無論對四環(huán)素敏感還是耐藥都攜帶1種或多種耐藥基因，這可能與基因選擇性表達有關，同時可觀察到生豬肉加工廠食品接觸面Tet-R多為核糖體保護基因，與王珊珊[13]等人的研究結果類似。Rukayya[14]對接受常規(guī)農(nóng)場治療而未使用抗微生物劑的豬的糞便大腸桿菌的表型-基因型抗微生物耐藥性（AMR）模式與常規(guī)使用抗生素超過70天的豬的比較，發(fā)現(xiàn)兩組動物中均能檢測出Tet-R（63.9%的分離物中發(fā)現(xiàn)至少一個四環(huán)素抗性基因），且在生長階段也檢測到了Tet-R，因此認為豬的ARGs可以在生長過程中的任何階段形成，且與是否直接接觸抗生素關系不是十分密切。

生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的廢棄物同樣有很高的Tet-R檢出。Cheng W等[15]利用熒光定量PCR方法對中國東南地區(qū)5省的16個養(yǎng)殖場中的5類抗生素（四環(huán)素類、磺胺類、喹諾酮類、氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類）的21種耐藥基因進行定量調(diào)查，發(fā)現(xiàn)糞便樣品中tet（M）基因是污染程度最重的基因之一，其相對豐度達到了copies/g，陽性率大于90%。土壤樣品中tet（C）、tet（M）為優(yōu)勢基因，濃度高于copies/g。任雪麗[16]等對上海市松江區(qū)養(yǎng)豬場的豬糞耐四環(huán)素乳糖發(fā)酵型腸桿菌（TR-LFE）進行四環(huán)素抗性基因檢測，檢測菌株總數(shù)的74.03%攜帶至少1種或2種Tet-R基因，樣品的乳糖發(fā)酵型腸桿菌中tet（R）基因檢出率范圍為3.12%～96.87%。tet（A）和tet（B）在所有樣品中均有檢測到，與Al-Bahry SN[17]和Roberts[18]等的研究結果基本吻合。Tet-R的分布存在一定的時間分布特征，tet（S）則僅出現(xiàn)在9月份和11月份，tet（M）幾乎在每個季度的豬糞中的TR-LFE中都有檢測到，而所有樣品中都沒有檢測到編碼核糖體蛋白的tet（O）和tet（X）。在生豬養(yǎng)殖場廢水中的情況則有所不同[19]，Cheng等[15]檢測了豬場廢水中的四環(huán)素抗性基因，發(fā)現(xiàn)編碼核糖體蛋白的抗性基因（tetM、tetO、tetQ、tetW）比外排泵機制抗性基因（tetA、tetB、tetC、tetL）、編碼使抗生素失活的修飾酶的抗性基因（tetX）的豐度更高，分別為9.25×、5.53×、1.69× copies/16S rRNA。Tao等檢測了中國臺灣6個豬場污水處理系統(tǒng)中的耐藥基因，發(fā)現(xiàn)tetA、tetW（-）在所有樣品中均被檢出。

2 抗生素耐藥性（antimicrobial resistance，AMR）常見分子生物學檢測方法——聚合酶鏈式反應（PCR）

PCR是1980年代開發(fā)的技術，在分子生物學中應用廣泛[20-21]。常規(guī)PCR包括3個步驟：在95 ℃下使雙鏈DNA變性，在50～60 ℃下對PCR引物進行退火，以及在72 ℃下進行DNA延伸。結束后可通過瓊脂糖凝膠電泳技術并用溴化乙錠或其他熒光DNA螯合染料對DNA染色來可視化PCR擴增的基因產(chǎn)物。

PCR技術發(fā)展迅速且已較成熟，一些進展如：實時PCR（RT-PCR）和等溫擴增。實時PCR又稱為定量PCR（qPCR），反應體系中存在有利于實時監(jiān)測目標DNA序列擴增的熒光染料，因此在PCR后無須進行可視化電泳操作步驟，省時且更加安全[22]，越來越多的研究選用qPCR進行AMR檢測。RT-PCR可以使用插入任何雙鏈DNA的非特異性染料，或者由寡核苷酸組成的序列特異性DNA探針，這些寡核苷酸用熒光來報告基因標記，只有在探針與其互補序列雜交后才能進行檢測順序[23]。等溫PCR（如LAMP和RPA）的特殊之處則在于整個過程在恒定的溫度下進行，具有條件要求簡單、資源要求低、適用于現(xiàn)場操作觀察等特點。多重PCR在檢測革蘭氏陰性細菌中與頭孢菌素或碳青霉烯[24]抵抗有關的β-內(nèi)酰胺酶時也體現(xiàn)出了投入少、時間消耗少等優(yōu)勢。RT-PCR的優(yōu)勢在于可以檢測特定基因中的點突變，而普通PCR則無法做到。q-PCR常常用于較短片段的檢測，而常規(guī)PCR則能用于大片段的檢測。PCR作為該領域的主要技術仍在蓬勃發(fā)展：Glocker等利用RT-PCR檢測16S rRNA基因突變，且能夠區(qū)分出野生型菌株和表現(xiàn)出單堿基對、雙堿基對或三堿基對突變的抗性菌株[25]。

3 結論與展望

由于技術、經(jīng)濟、管理等各方面的限制，我國豬肉生產(chǎn)鏈中Tet-R污染嚴重，耐藥基因分布存在一定的空間分布特征和時間分布特征。在養(yǎng)殖環(huán)節(jié)，廢棄物未能得到妥善處理，廢水大多直接排放或進行簡單處理即排放，急需新的能夠降低廢水中ARGs殘留的廢棄物處理工藝;生豬糞便多采用簡單堆放風干處理，少數(shù)進行堆肥或發(fā)酵處理。堆肥能有效降低有機肥料中的四環(huán)素抗性基因殘留，但是也增加了向土壤中播撒ARGs的風險。從屠宰到生產(chǎn)零售環(huán)節(jié)，由于加工面的污染，也使得豬肉中Tet-R的污染情況增加。由于四環(huán)素在豬肉產(chǎn)業(yè)鏈中作為促生長劑和抑菌藥而占據(jù)重要地位，Tet-R的污染情況十分值得關注，針對此現(xiàn)狀本文提出如下建議：①避免創(chuàng)造適于抗性基因選擇、動員和儲存的環(huán)境。如：制定糞便堆肥的相關技術指標，改良污水處理工藝等。②阻斷耐藥菌向致病微生物組的擴散途徑。制定關于農(nóng)業(yè)廢棄物排放的法律法規(guī)，減少農(nóng)業(yè)廢棄物的使用，從而降低環(huán)境中的ARGs傳播給人類、糧食作用和野生生物的風險。③限制抗藥性病原體的選擇壓力，對人和動物謹慎使用抗生素。優(yōu)化牲畜的生活條件，以減少中國食用動物的抗生素消耗;臨床上規(guī)范合理用藥等。④建立完善健全的監(jiān)測管理系統(tǒng)。從Tet-R的多樣性可見，還有更多的抗性基因可供病原體吸收。即使沒有直接的抗生素選擇壓力，Tet-R仍然有出現(xiàn)的可能，并且已存在的Tet-R不可能被消除。在病原體中出現(xiàn)的新的ARGs有可能會給人類健康、畜牧業(yè)等帶來毀滅性的打擊。因此在國家積極引導以及科研人員密切配合下建立標準統(tǒng)一的，免費共享的，定期更新的監(jiān)測管理系統(tǒng)是控制抗生素污染的重要措施。

參考文獻

[1]Heuer H， Schmitt H， Smalla K. Antibiotic resistance gene spread due to manure application on agricultural fields[J]. Current Opinion in Microbiology， 2011， 14（3）： 236-243.

[2]Thompson S，Maani E，

Lindell A，et al. Novel tetracycline resistance determinant isolated from an environmental strain of Serratia marcescens[J].Applied and environmental microbiology，2007，73（7）：2199-2206.

[3]Zhao L， Dong Y， Wang H. Residues of veterinary antibiotics in manures from feedlot livestock in eight provinces of China[J]. Sci Total Environ，2010，108（5）：1642-1656.

[4]羅義，周啟星.抗生素抗性基因（ARGs）—一種新型環(huán)境污染物[J].環(huán)境科學學報，2008，28（8）：13-19.

[5]Naquin A， Shrestha A， Sherpa M， et al. Presence of antibiotic resistance genes in a sewage treatment plant in Thibodaux， Louisiana， USA[J]. Bioresource Technology，2015，188（11）：79-83.

[6]喬博超，吳楠，楊靜慧，等.環(huán)境中抗生素抗性基因的來源、分布及控制對策[J].天津農(nóng)林科技，2017（260）：16-18.

[7]羅曉，袁立霞，張立麗，等.制藥廢水廠抗性基因和微生物群落相關性研究[J].中國環(huán)境科學，2019，39（2）：831-838.

[8]Hoelzel Christina， Huther S， Schwaiger K， et al. Quantity of the Tetracycline Resistance Gene tet（M） Differs Substantially between Meat at Slaughterhouses and at Retail[J]. Journal of Food ence， 2011， 76（6）：318-323.

[9]Calero Guillermo， Gomez N， Benomar N， et al. Deciphering Resistome and Virulome Diversity in a Porcine Slaughterhouse and Pork Products Through Its Production Chain[J]. Frontiers in Microbiology， 2018，9：e02099.

[10]Looft T， Johnson T， Allen H， et al. In-feed antibiotic effects on the swine intestinal microbiome[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 2012， 109（5）：1691-1696.

[11]王學君，譚艾娟，呂世明，等.貴州省豬源大腸桿菌對四環(huán)素類藥物的耐藥性及耐藥基因檢測[J].中國畜牧獸醫(yī)，2018，45（5）：1367-1373.

[12]孟赫誠，魏思羽，李麗麗.生豬肉加工廠食品接觸面四環(huán)素耐藥菌及其耐藥基因的分布[J].現(xiàn)代食品科技，2019，35（4）：30-35.

[13]王珊珊.廈門某屠宰場豬肉中四環(huán)素耐藥菌的分離鑒定及耐藥基因的分布研究[D].廣州：華南理工大學，2014.

[14]Abubakar Rukayya， Madoroba E， Adebowales O， et al. Antimicrobial Usage in Pig Production： Effects on Escherichia Coli Virulence Profiles and Antimicrobial Resistance[J]. Onderstepoort Journal of Veterinary Research， 2019，86（1）： 1–11.

[15]Cheng W， Chen H， Su C，et al. Abundance and persistence of antibiotic resistance genes in livestock farms： A comprehensive investigation in eastern China[J]. Environment international， 2013， 61：1-7.

[16]任雪麗，嚴劍芳，王曉慧，等.四環(huán)素耐藥基因在養(yǎng)豬場豬糞和土壤中的分布研究[J].安徽農(nóng)學通報，2016，22（7）：13-14.

[17]Al-Bahry S， Al-Mashani B， Al-Ansari A， et al. Escherichia coli tetracycline efflux determinants in relation to tetracycline residues in chicken[J]. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine， 2013（9）：718-722.

[18]Roberts M. Update on acquired tetracycline resistance genes[J]. Fems Microbiology Letters，2005（2）：195-203.

[19]Wu N， Qiao M， Zhang B， et al. Abundance and diversityof tetracycline resistance genes in soils adjacent torepresentative swine feedlots in China[J]. Environ SciTechnol，2010，44（18）：6933-6939.

[20]TaoW， HsuM， Ji T，et al. Evaluation of five antibiotic resistance genes in wastewater treatment systems of swine farms by real-time PCR[J]. Science of the Total Environment， 2014， 496：116-121.

[21]Saiki R， Gelfand H， Stoffel S，et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase[J]. Science， 1988， 239（4839）：487-491.

[22]Duggett A， Sayers E， AbuOun M， et al. Occurrence and characterization of mcr-1-harbouring Escherichia coli isolated from pigs in Great Britain from 2013 to 2015[J]. Journal of Antimicrobial Chemotherapy， 2017，72：691-695.

[23]AryaM， Shergill S， Williamson M， et al. Basic principles of real-time quantitative PCR[J]. Expert Review of Molecular Diagnostics， 2005， 5（2）：209-219.

[24]Solanki R， Vanjari L， Subramanian S， et al. Comparative Evaluation of Multiplex PCR and Routine Laboratory Phenotypic Methods for Detection of Carbapenemases among Gram Negative Bacilli[J]. Journal of Clinical & Diagnostic Research， 2014， 8（12）： 23-26.

[25]Glocker E， Berning M， Gerrits M， et al.Real-time PCR screening for 16S rRNA mutations associated with resistance to tetracycline in Helicobacter pylori[J]. Antimicrob. Agents Chemother.2005，49（8）：3166-3170.