黃小蘭，何旭峰，周祥德，郭冬琴，張椿翊，趙順鑫，谷文超，周濃

1(重慶三峽學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，三峽庫區(qū)道地藥材綠色種植與深加工重慶市工程實(shí)驗(yàn)室，重慶，404100)2(重慶市萬州食品藥品檢驗(yàn)所，重慶，404100)

地參為唇形科地筍屬植物硬毛地筍Lycopuslucidusvar.hirtusRegel的干燥根莖，其性平、味甘，有化瘀止血、益氣利水之功效[1]，是我國名貴的中草藥，曾收載于2009版《湖南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》[2]，晚秋以后采挖出飽滿脆嫩的根莖可作蔬菜食用，營養(yǎng)豐富、味道鮮美，享有“蔬菜珍品”之美譽(yù)，是一種傳統(tǒng)的藥食兼用佳品[3]。前期研究表明地參主要含有酚酸類[4]、多糖類[5]、揮發(fā)油[6]、三萜類、黃酮類[7-8]等資源性化學(xué)成分，具有抗氧化、抗炎、增強(qiáng)免疫、降血糖血脂、抗腫瘤等多種生物活性[9-11]，極具藥用價(jià)值，同時(shí)地參還含有豐富的氨基酸、粗蛋白、礦物元素等物質(zhì)[12-14]，營養(yǎng)價(jià)值高。

礦物元素是促進(jìn)植物光合作用和有機(jī)物合成必不可少的成分[15]，是評價(jià)食材營養(yǎng)價(jià)值和安全性的重要因素[16]。近年來興起的“元素醫(yī)學(xué)”研究發(fā)現(xiàn)，礦物元素對中藥的療效有促進(jìn)和協(xié)同作用[17-18]。礦物元素的種類和含量不僅與植物的種類、年份等自身因素有關(guān)，還與種植的環(huán)境因素(土壤、氣候、水源等)以及肥料施用情況有關(guān)，可以表征不同產(chǎn)地的品質(zhì)差異，用于藥材產(chǎn)地判別[19]，同時(shí)藥材中重金屬超標(biāo)問題也日益突出，成為影響其安全性和進(jìn)出口的重要因素[20]。因此，研究地參中元素的種類和含量，分析其分布規(guī)律，可對地參品質(zhì)評價(jià)和栽培引種提供參考。

目前，元素測定的方法主要集中在原子吸收光譜法[21]、原子熒光光譜法[22]、電感耦合原子發(fā)射光譜法(inductively coupled plasma optical emission spectrometer,ICP-OES)[14,16]、電感耦合等離子體質(zhì)譜法(inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS)[18,20,23]等。原子吸收光譜法效率低、耗時(shí)長，且存在較強(qiáng)的基體效應(yīng)[24]；原子熒光光譜法靈敏度高，被廣泛應(yīng)用于食品中砷、汞的測定，是食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)制使用方法[25-26]；ICP-OES法可同時(shí)進(jìn)行多元素測定，但靈敏度較低，不利于痕量元素的檢測；而ICP-MS法具有靈敏度高、干擾少、線性動(dòng)態(tài)范圍寬且樣品引入方便等優(yōu)點(diǎn)，適用于不同含量級別的多元素同時(shí)測定[27-28]，是目前較為常用的元素測定方法。微波消解前處理技術(shù)相較于干法和濕法消解具有消解更徹底、速度快且損失小等優(yōu)點(diǎn)[28]，應(yīng)用較廣。

地參在我國大部分地區(qū)都有分布和栽培，其中以云南、廣西、江蘇、山東、四川、重慶等地為主產(chǎn)區(qū)[29]，目前，針對不同產(chǎn)地地參元素的系統(tǒng)研究未見報(bào)道。因此，本研究利用凱氏定氮法，微波消解前處理技術(shù)結(jié)合ICP-MS和氫化物原子熒光光譜法首次對我國地參主產(chǎn)區(qū)栽培品種中22種元素進(jìn)行測定，并利用相關(guān)性、主成分和聚類分析對其進(jìn)行分析和評價(jià)，基本代表了我國主產(chǎn)區(qū)地參中元素的總體情況，以期為地參藥食兼用的藥用價(jià)值、營養(yǎng)價(jià)值以及安全性提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，也為地參資源的栽培引種、產(chǎn)地判別和開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

地參自采或委托采集于我國地參主要栽培基地，詳見表1，鑒定為唇形科地筍屬植物硬毛地筍的干燥根莖。將地參洗凈泥沙，晾干水分，置于恒溫干燥箱45 ℃烘干至恒重，將其粉碎過35目篩，備用。

表1 地參產(chǎn)地信息Table 1 The habitats of Lycopus lucidus var. hirtus Regel

單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 μg/mL)：K(GSB04-1733-2004)、Na(GSB04-1738-2004)、Ca(GSB04-1720-2004)、Mg(GSB04-1735-2004)、Al(GSB04-1713-2004)、P(GSB04-1741-2004)、Fe(GSB04-1726-2004)、Zn(GSB04-1761-2004)、Se(GSB04-1751-2004)、Cu(GSB04-1725-2004)、Co(GSB04-1722-2004)、Ba(GSB04-1717-2004)、Mo(GSB04-1737-2004)、B(GSB04-1716-2004)、Ni(GSB04-1740-2004)、Mn(GSB04-1736-2004)、Cd(GSB04-1721-2004)、Cr(GSB04-1723-2004)、Pb(GSB04-1742-2004)、As(GSB04-1714-2004)、Hg(GSB04-1729-2004)，國家有色金屬及電子材料分析測試中心；MOS級濃HNO3,北京化學(xué)試劑研究所；實(shí)驗(yàn)用水為去離子超純水；其他試劑均為優(yōu)級純，成都科龍?jiān)噭S。實(shí)驗(yàn)所用容量瓶、移液管、燒杯等玻璃器皿均采用10%(體積分?jǐn)?shù))HNO3溶液浸泡24 h，然后用去離子超純水沖洗干凈，備用。

1.2 主要儀器

EXPEC 7000型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，聚光科技(杭州)股份有限公司；AFS-8510型原子熒光光度計(jì)，北京海光儀器有限公司；MARS6型高壓微波消解儀，美國CEM公司；Kjeltec 8400型全自動(dòng)凱氏定氮儀，丹麥FOSS分析儀器公司；Milli-Q Advantage A10型超純水機(jī)，美國Millipore公司；SQP Sartorius型萬分之一電子天平，德國Sartorius公司。

1.3 分析方法

1.3.1 樣品前處理

(1)稱取地參樣品粉末0.35 g(精確至0.000 1 g)于消化管中，參照標(biāo)準(zhǔn)[30]制備樣品消化液，全自動(dòng)凱氏定氮儀蒸餾滴定測定N元素含量。

(2)取地參樣品粉末0.25 g(精確至0.000 1 g)于聚四氟乙烯消解罐內(nèi)，加入8 mL濃HNO3，密封，浸泡過夜，置于微波消解儀中，按設(shè)定的消解程序處理：先經(jīng)12 min由室溫升溫至150 ℃，保持10 min，然后以8 ℃/min的速率升溫至190 ℃，保持20 min。消解完全后，取出消解罐，在通風(fēng)櫥中以120 ℃將酸揮盡，轉(zhuǎn)移并用去離子超純水定容至50 mL容量瓶中。取8 mL濃HNO3同法制備空白溶液。Hg測定時(shí)，無需揮酸，直接轉(zhuǎn)移定容至25 mL測定；As測定時(shí)，加入5%硫脲和5%抗壞血酸2.5 mL，50%(體積分?jǐn)?shù)) HCl 2.5 mL，定容至25 mL反應(yīng)30 min后測定。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備

分別精密移取21種元素標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用0.5%(體積分?jǐn)?shù))HNO3溶液逐級稀釋，配制成K、Na、Ca、Mg、Al、P、Fe質(zhì)量濃度為0、40、200、400、1 200、2 000 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液1；B、Mn、Zn、Cu、Ba質(zhì)量濃度為0、10、50、100、300、500 μg/L，Se、Co、Ni、Cd、Cr、Pb質(zhì)量濃度為0、1、5、10、30、50 μg/L、Mo質(zhì)量濃度為0、0.1、0.5、1、3、5 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液2，供ICP-MS分析。As質(zhì)量濃度為0、2、4、8、12、16 μg/L，Hg質(zhì)量濃度為0、0.4、0.8、1.6、2.4、3.2 μg/L，供氫化物原子熒光光譜法分析。

1.3.3 元素測定

調(diào)節(jié)各儀器條件，優(yōu)化其工作參數(shù)，采用全自動(dòng)凱氏定氮儀測定N，氫化物發(fā)生原子熒光光譜法測定As、Hg ICP-MS測定K、Na、Ca、Mg、Al、P、Fe、B、Mn、Zn、Cu、Ba、Se、Co、Ni、Cd、Cr、Pb、Mo。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 方法的線性關(guān)系

將1.3.2的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液按照優(yōu)化后的儀器參數(shù)進(jìn)樣測定，儀器工作站自動(dòng)得出各元素的線性回歸方程及線性關(guān)系。線性回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)如表2所示，結(jié)果顯示各元素標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相關(guān)系數(shù)為0.998 1～0.999 9，表明所用方法線性關(guān)系均良好。

2.1.2 精密度試驗(yàn)

取同一標(biāo)準(zhǔn)溶液按1.3.3平行測定6次，計(jì)算各元素濃度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)值。結(jié)果顯示各元素RSD值為0.58%～2.79%，表明儀器精密度良好，符合分析方法要求。

2.1.3 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取地參樣品(S1)0.25 g，平行6份，按1.3.1進(jìn)行樣品溶液制備，1.3.3測定并計(jì)算各元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD值為1.09%～2.49%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一樣品溶液(S1)，按1.3.3每隔0.5 h測定1次，持續(xù)6次，測定各元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)，計(jì)算RSD值為0.67%～2.85%，表明樣品溶液在3 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表2 21種元素的線性回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)Table 2 Linear equation, linear range and correlation coefficient of 21 kinds elements

2.1.5 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已測定含量的地參樣品(S1)0.25 g各6份，分別加入各元素標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，按1.3.1項(xiàng)下進(jìn)行樣品溶液制備，1.3.3項(xiàng)下測定并計(jì)算回收率和RSD值，結(jié)果表明各元素的平均回收率為94.36%～108.05%，RSD值為0.97%～2.68%，符合分析方法要求。

2.2 地參樣品中22種元素測定結(jié)果

取10個(gè)不同產(chǎn)地地參樣品按1.3.1進(jìn)行樣品溶液制備，平行3份，并測定，結(jié)果見表3，地參中含有豐富的營養(yǎng)元素和無機(jī)元素，不同產(chǎn)地元素種類大致相同，但含量存在一定差異。

營養(yǎng)元素N是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)元素，含量較高，不同產(chǎn)地平均含量為20.01 mg/g。其中南方產(chǎn)區(qū)(S1、S2、S3、S4、S5)的含量極為接近，平均含量為13.12 mg/g；北方產(chǎn)區(qū)(S6、S7、S8、S9)的結(jié)果更為接近，平均值為23.81 mg/g，約為南方的2倍；產(chǎn)自江蘇宿遷(S10)的地參樣品中含量最高，為39.26 mg/g。地參中P平均含量為3.10 mg/g，不同產(chǎn)地的含量規(guī)律同N元素。

在20種無機(jī)元素中，K、Ca、Mg這3種元素的平均含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他元素，其中含量最高的是K，平均值為21.98 mg/g，其次是Ca(1.81 mg/g)和Mg(1.24 mg/g)。K含量在樣品S1～S6中基本一致，但在同為江蘇產(chǎn)地的S10樣品中達(dá)到最高值(26.47 mg/g)，S8中最低(17.63 mg/g)；Ca、Mg在不同產(chǎn)區(qū)含量無明顯規(guī)律，江蘇徐州(S7)樣品中Ca、Mg含量均為最高。

微量元素中Na含量最高，平均含量為315.58 μg/g，但樣品中Na的含量相差較大，江蘇鹽城(S8)樣品中Na含量最高(929.80 μg/g)，約為江蘇沛縣(S9)樣品的13倍。其次是Al(246.50 μg/g)、Fe(156.14 μg/g)、Zn(37.01 μg/g)、Mn(29.23 μg/g)、Cu(25.94 μg/g)、Ba(9.90 μg/g)、Ni(6.26 μg/g)、B(3.98 μg/g)、Cr(1.12 μg/g)、Mo(0.76 μg/g)、Co(0.52 μg/g)，Se具有較低的含量(0.132 μg/g)。重慶萬州(S1)樣品中Fe、Al、Mn、Ba、Co含量最高，江蘇徐州(S7)樣品中Zn、Cu、Cr、Se、B含量最高，廣西玉林(S5)樣品中Ni含量最高，江蘇沛縣(S9)樣品中Mo含量最高。

重金屬元素中，Cu的含量范圍在17.50～52.84 μg/g，平均含量25.94 μg/g；Cd含量范圍為0.009～0.177 μg/g，平均含量0.054 μg/g；Pb含量為0.069～2.141 μg/g，平均含量0.517 μg/g；As含量為0.040～0.730 μg/g，平均含量0.233 μg/g；Hg的含量最低(0.010 μg/g)。Cd、Hg在各產(chǎn)區(qū)中的含量相差不大，Pb、As存在較大差異，江蘇徐州(S7)樣品中Pb、As含量均為各產(chǎn)區(qū)中最高，但均未超過《藥用植物及制劑外經(jīng)貿(mào)綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》[31]的相關(guān)規(guī)定(Pb≤5.0 μg/g，As≤2.0 μg/g)，而樣品S1、S4、S6～S10中的Cu及重金屬總量均超標(biāo)(Cu≤20.0 μg/g，總量≤20.0 μg/g)。

2.3 地參樣品中22種元素含量的相關(guān)性分析

相關(guān)性分析采用文獻(xiàn)[17-18]報(bào)道的方法，利用SPSS 20軟件對各元素進(jìn)行分析，結(jié)果詳見表4，地參中有31對元素呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)：Ca-Mg、N-P、Fe-Ba、P-Se、Fe-Co、Ba-Co、N-Mo、K-As、Mg-Se、Mg-Cu、Fe-Mn、Fe-Al等，地參中還有15對元素呈正相關(guān)(P<0.05)：K-Mg、K-P、Ca-Fe、Mg-P、Zn-Se、P-Mo、N-As、Ca-Al、Zn-Cu等，表明上述46對元素在吸收積累過程中具有較好的協(xié)同作用，例如元素Mg能促進(jìn)植物對Ca、Se、Cu、K、P的吸收富集，元素Fe能促進(jìn)植物對Ba、Co、Mn、Al、Se、Ca的吸收富集。樣品中N-Co、Co-B、Ba-Mo、N-Cd這4對元素呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，Co-Mo、Mo-Cd這2對元素呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，表明這6對元素在吸收累積過程中存在拮抗作用，例如Co元素會(huì)抑制植物對N、B、Mo的吸收富集，Cd元素會(huì)抑制植物對N、Mo的吸收富集。

表3 不同產(chǎn)地地參中22種元素測定結(jié)果(n=3)Table 3 Determination of 22 kinds of elements in samples from different habitats(n=3)

表4 不同產(chǎn)地地參中22種元素間的相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis of 22 elements in Lycopus lucidus var. hirtus Regel from different habitats

2.4 地參樣品中22種元素的主成分分析

2.4.1 主成分篩選及貢獻(xiàn)率

由于地參中各元素含量在量綱上存在較大差異，為了保障分析結(jié)果的客觀準(zhǔn)確，利用SPSS 20對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后，再進(jìn)行主成分分析，得到主成分特征值及貢獻(xiàn)率。如表5所示,提取到4個(gè)主成分因子(特征值>1)，前2個(gè)主成分累積貢獻(xiàn)率達(dá)70.144%，主成分1主要反映了元素Mg、Pb、Cu的貢獻(xiàn)，主成分2主要反映了Co、Cd、Ba的特征貢獻(xiàn)，表明這2個(gè)因子在反映產(chǎn)地和地參中各元素的相互關(guān)系中起主導(dǎo)作用，能夠客觀反映兩者間的內(nèi)在聯(lián)系。

表5 主成分的特征值及方差貢獻(xiàn)率Table 5 Eigenvalues and variance contribution of principle components

2.4.2 主成分得分、綜合評分及產(chǎn)地排序

利用每個(gè)主成分所對應(yīng)的特征值占所提取主成分總特征值之和的比例作為權(quán)重得到綜合主成分表達(dá)式為F綜=0.417F1+0.362F2+0.132F3+0.088F4，并根據(jù)綜合得分情況對不同產(chǎn)地進(jìn)行排序，如表6所示,重慶萬州(S1)、江蘇徐州(S7)、廣西玉林(S5)的樣品綜合得分排名前3，但由于S1和S7中Cu和重金屬總量均超標(biāo)，故從元素角度考慮，廣西玉林(S5)地參品質(zhì)較優(yōu)。

表6 樣品主成分得分、綜合得分及其排序Table 6 Principal component scores, comprehensive scores and ranking

2.5 地參樣品中22種元素聚類分析

采用SPSS 20對10批不同產(chǎn)地地參樣品進(jìn)行聚類分析，以22種元素作為變量可以分為三大類，樣品S1為第Ⅰ類，S7為第Ⅱ類，這與主成分分析中綜合排序結(jié)果一致；其余8組樣品歸為第Ⅲ類，其中在第Ⅲ類中，S2、S3、S4、S5(南方)和S6、S8、S9、S10(北方)又可獨(dú)立成2個(gè)小類，該結(jié)果表明地域接近的產(chǎn)地能夠很好的聚為一類，說明樣品中元素的含量差異跟產(chǎn)地密切相關(guān)，存在地域性特征，可為地參的產(chǎn)地判別提供參考。

圖1 樣品的聚類分析Fig.1 Cluster analysis of samples

3 結(jié)論與討論

植物中元素含量多與生態(tài)因子土壤、氣候以及施肥狀況有關(guān)，且植物不同部位對元素的吸收富集存在差異[20]。植物在生長發(fā)育過程中，根莖作為營養(yǎng)成分等物質(zhì)的直接吸收者，直接與土壤、肥料接觸，其元素含量需監(jiān)測評估。地參作為以根莖為藥用和食用部位的植物，測定其營養(yǎng)元素、微量元素和重金屬元素對其品質(zhì)評價(jià)具有重要意義。

研究結(jié)果顯示，10批不同產(chǎn)地地參中所含元素的種類基本一致，含量高低順序?yàn)镵>N>P>Ca>Mg>Na>Al>Fe>Zn>Mn>Cu>Ba>Ni>B>Cr>Mo>Pb>Co>As>Se>Cd>Hg。植物細(xì)胞中高濃度的K+可調(diào)節(jié)生長素和細(xì)胞分裂素的分泌從而影響其根莖的形成與生長，N、P元素作為構(gòu)成蛋白質(zhì)的必需元素，含量高低直接影響其新陳代謝速率與根莖的生長[32]，所以在地參的生長過程中，應(yīng)施予足夠的鉀肥和氮肥，以供正常生長所需，提高產(chǎn)量。Ca、Mg作為地參的無機(jī)特征元素，是地參生長發(fā)育、有效成分積累過程中的重要參與者。Ca是人體必需的礦物質(zhì)元素，是生物體許多生理生化過程的觸發(fā)器，是構(gòu)成人體骨骼和牙齒的主要成分，地參中平均Ca含量高達(dá)1.81 mg/g，可用于開發(fā)為Ca補(bǔ)充劑。Mg參與人體中幾乎所有的新陳代謝過程，特別是對心臟活動(dòng)、心血管系統(tǒng)有很好的調(diào)節(jié)和保護(hù)作用。地參中還有其他有利的微量元素，如Fe是人體必需的微量元素，組成血紅蛋白的重要成分，參與氧的運(yùn)輸和儲(chǔ)存；Zn作為人體中多種酶的組成成分參與酶活動(dòng)，能促進(jìn)人體新陳代謝，提高免疫功能；Mn與人體中蛋白質(zhì)、脂肪和碳水化合物的代謝密切相關(guān)，且是多種中藥生物酶的活性中心。

Cu是人體的必需微量元素，但同時(shí)也是有害金屬元素，人體中蓄積過多會(huì)引起中毒。本研究對不同產(chǎn)地地參中重金屬進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，所有產(chǎn)地Cu含量普遍較高，來自山東菏澤、江蘇一帶的北方產(chǎn)地Cu含量均超標(biāo)，特別是S7(江蘇徐州)超過限量值近2倍，且其Pb和As含量在10個(gè)產(chǎn)地中含量同樣最高。因此，在地參的規(guī)范化栽培過程中，應(yīng)對其土壤和肥料的重金屬進(jìn)行監(jiān)控，提高地參質(zhì)量及安全性。

本研究采用凱氏定氮法、氫化物原子熒光光譜法及ICP-MS測定了不同產(chǎn)地地參中的營養(yǎng)元素、微量元素及重金屬元素含量，基本涵蓋了我國地參主產(chǎn)區(qū)，可大致反映地參中元素基本情況，并通過相關(guān)性分析、主成分分析和聚類分析進(jìn)行綜合評價(jià)，為地參的栽培引種、質(zhì)量控制、安全性評價(jià)、產(chǎn)地判別和開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。