陽曦，劉瑋

(綿陽市食品藥品檢驗(yàn)所，四川 綿陽，621000)

涪城麥冬，是原產(chǎn)于四川省綿陽三臺縣的道地藥材。研究表明，麥冬中生物活性成分含量豐富，主要有皂苷、黃酮、氨基酸、核苷、多糖類等物質(zhì)[1-2]。氨基酸有明顯的耐缺氧作用，氨基酸和核苷類成分具有調(diào)節(jié)免疫力，調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)、改善細(xì)胞代謝等生理活性功能[3-4]。2019年1月，四川省衛(wèi)生健康委員會發(fā)布了“麥冬須根”的食品安全地方標(biāo)準(zhǔn)DBS 51/ 007—2019《食品安全地方標(biāo)準(zhǔn) 麥冬須根》[5]，意味著麥冬須根成為四川新的特色食品原料，有望進(jìn)入“藥食同源”目錄。

目前，食品中氨基酸的測定國家標(biāo)準(zhǔn)方法為GB 5009.124—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測定》，采用的是茚三酮柱后衍生離子交換色譜儀法[6]，需要專有設(shè)備，氨基酸自動(dòng)分析儀，該方法的缺點(diǎn)是前處理過程繁雜，分析時(shí)間冗長。文獻(xiàn)報(bào)道主要的檢測方法為氨基酸自動(dòng)分析儀法[7-8]、茚三酮染色紫外比色法[9-10]、高效液相色譜法[11-12]、近紅外光譜法[13-14]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[15-16]。茚三酮比色法用于測定氨基酸總量，對某一組分的氨基酸無法進(jìn)行檢測。高效液相色譜法一般采用柱前衍生法，但前處理較為復(fù)雜，需要時(shí)間較長。液相色譜-質(zhì)譜法使用的C18色譜柱，氨基酸保留差，導(dǎo)致分離效果不理想，干擾物質(zhì)不容易分開。本試驗(yàn)采用親水作用色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(hydrophilic interaction chromatography-mass spectrometry，HILIC-MS/MS)對涪城麥冬中的多種氨基酸進(jìn)行直接測定，優(yōu)化了前處理方法，能夠快速、準(zhǔn)確的對氨基酸含量進(jìn)行分析測定。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)苯丙氨酸、色氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、纈氨酸、脯氨酸、酪氨酸、丙氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、組氨酸、賴氨酸，中國檢驗(yàn)檢定科學(xué)研究院；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)亮氨酸，Dr.Ehrenstorfer GmbH；乙腈、甲酸(色譜純),Fisher公司；乙酸銨(分析純)，成都科隆。

樣品：涪城麥冬共10批。

4000 Q TRAP高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國AB SCIEX公司； ME204T/02電子天平，瑞士梅特勒-托利多有限公司； XSE205電子天平，瑞士梅特勒-托利多有限公司； Direct-Q超純水機(jī)，美國Millipore公司；Poroshell 120 HILIC-Z色譜柱，美國安捷倫科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取苯丙氨酸、亮氨酸、色氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、纈氨酸、脯氨酸、酪氨酸、丙氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、組氨酸、賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各20 mg，置50 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，制成各氨基酸質(zhì)量濃度分別為 0.4 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液。臨用時(shí)，吸取適量用水稀釋成不同濃度系列的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 樣品前處理

樣品經(jīng)粉碎后，稱取試樣0.1 g，于200 mL碘量瓶中，精密加入100 mL超純水，超聲提取(250 W，50 kHz)30 min，冷卻，經(jīng)0.22 μm水系濾膜過濾后，待測定。

1.2.3 液相色譜條件

色譜柱： Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z(2.1 mm×100 mm，2.7 μm)；流速0.4 mL/min；進(jìn)樣量2 μL；柱溫30 ℃；流動(dòng)相A：乙腈、流動(dòng)相B10 mmol/L乙酸銨溶液(含0.05%甲酸)；梯度洗脫見表1。

1.2.4 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧電離源；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測；掃描方式：正離子掃描； 離子化電壓：5 500 V；離子源溫度：550 ℃；氣簾氣壓力：25 psi；噴霧器壓力：55 psi；輔助加熱器壓力：50 psi；碰撞器：Medium；碰撞室入口電壓：10 V；碰撞室出口電壓：12 V；具體參數(shù)見表2。

表2 質(zhì)譜分析參數(shù)Table 2 Mass spectrometric analysis parameters

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

去簇電壓和碰撞能量對氨基酸的裂解及靈敏度有重大影響。因此我們優(yōu)化了每一種氨基酸的質(zhì)譜條件，以確保其能獲得高靈敏度的分析參數(shù)。在電噴霧離子源下，采用正離子模式，通過針泵進(jìn)樣，將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液泵入質(zhì)譜儀。第1步選擇Q1 MS掃描模式，根據(jù)不同氨基酸的相對分子質(zhì)量及結(jié)構(gòu)，找到對應(yīng)的母離子，并分別確定母離子的質(zhì)荷比m/z。第2步調(diào)整為Product lon(MS2) 掃描模式，以5 eV為步長，由低到高逐步增加，優(yōu)化碰撞能量CE，每種氨基酸分別選擇2個(gè)響應(yīng)值最強(qiáng)的碎片離子作為子離子。第3步調(diào)整掃描模式為多反應(yīng)監(jiān)測，選擇豐度最大和豐度其次的子離子分別作為每種氨基酸的定量定性離子，確定2組檢測離子對，再進(jìn)一步優(yōu)化碰撞能量CE和去簇電壓DP，確定最佳分析條件，見表2。在該質(zhì)譜條件下，大部分氨基酸在二級質(zhì)譜碎片中產(chǎn)生了一個(gè)丟失甲酸的碎片離子[M+H-46]+。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇

本試驗(yàn)對比了常規(guī)的C18色譜柱和HILIC色譜柱的保留行為。首先采用了普通C18色譜柱(3.0 mm×100 mm，3 μm)，流動(dòng)相采用V(乙腈)∶V[10 mmol/L乙酸銨溶液(含甲酸體積分?jǐn)?shù)為0.05%)]=5∶95，但氨基酸具有較強(qiáng)極性，即使在乙腈只占5%的流動(dòng)相體系中，各氨基酸在普通的C18色譜柱上保留效果及峰形也較差，絕大多數(shù)在2 min內(nèi)出峰，見圖1。由于較早的出峰會增加共流出，導(dǎo)致很多強(qiáng)極性物質(zhì)進(jìn)入質(zhì)譜，造成一定的基質(zhì)效應(yīng)。

圖1 C18色譜柱色譜行為Fig.1 Chromatographic behavior of the C18 column

低水相及高有機(jī)相的流動(dòng)相模式是HILIC色譜常用的流動(dòng)相組成，乙腈作為常用的有機(jī)相，一般在流動(dòng)相中的使用比例大于50%，水作為強(qiáng)的洗脫溶劑，這樣的組成比例可以提高質(zhì)譜檢測的靈敏度，同時(shí)也避免污染較大的離子對試劑的使用，這些決定了HILIC很適合與質(zhì)譜檢測器聯(lián)用。Poroshell 120 HILIC-Z柱，是一款具有親水作用的色譜柱，如圖2所示，對1 μg/mL的氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，進(jìn)樣量2 μL，用乙腈及10 mmol/L乙酸銨溶液(含甲酸體積分?jǐn)?shù)為0.05%)梯度洗脫，在較短的保留時(shí)間內(nèi)得到了良好的峰形且分離度較好。對于樣品中同分異構(gòu)體亮氨酸和異亮氨酸，也能使色譜峰得到有效分離，見圖3。因此選擇Poroshell 120 HILIC-Z色譜柱作為本次試驗(yàn)的分離柱。

圖2 氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品總離子流圖Fig.2 Total ion chromatgrams of amino acid mixture standards

圖3 亮氨酸和異亮氨酸的色譜分離Fig.3 Chromatographic separation of leucine and isoleucine

2.2.2 流動(dòng)相的優(yōu)化

本試驗(yàn)采用乙腈-10 mmol/L乙酸銨溶液(含0.05%甲酸)作流動(dòng)相?？紤]到涪城麥冬生物成分比較復(fù)雜，可采取梯度洗脫對各成分進(jìn)行分離，同時(shí)能夠使待測氨基酸擁有合適的保留時(shí)間，且在梯度洗脫程序后階段使用較大比例水相的沖洗步驟，使其他干擾組分盡可能被沖出來，從而達(dá)到較好的檢測效果，同時(shí)可以保護(hù)色譜柱。流動(dòng)相中適量添加甲酸具有改善峰形的作用，因此在10 mmol/L乙酸銨溶液中加入了體積分?jǐn)?shù)0.05%的甲酸。經(jīng)過多次試驗(yàn)優(yōu)化，最后確定流動(dòng)相的比例及洗脫的程序(表1)。

2.2.3 進(jìn)樣體積的確認(rèn)

由于氨基酸易溶于水，為了提高樣品中氨基酸的提取效率，本試驗(yàn)采用純水作為目標(biāo)成分的提取溶劑。而試驗(yàn)所用的Poroshell 120 HILIC-Z柱，是親水作用的色譜柱，在液相分離模式中，水的洗脫能力大于乙腈。因此，由于水作為待測樣品溶液的溶劑，會造成比較強(qiáng)的溶劑效應(yīng)。在梯度洗脫的初始階段中，乙腈的比例為90%，完成進(jìn)樣后當(dāng)待測溶液與流動(dòng)相發(fā)生混合時(shí)，由于待測溶液溶劑洗脫能力強(qiáng)于流動(dòng)相溶劑，部分樣品得不到保留，會先被洗脫出來，使峰變形，往往表現(xiàn)出峰的前伸、展寬、分叉等現(xiàn)象。在不改變提取溶劑及流動(dòng)相的情況下，用減少進(jìn)樣體積的方式可以獲得良好的峰形，同時(shí)能夠降低溶劑效應(yīng)的影響。本試驗(yàn)通過對混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，比較了進(jìn)樣體積為2、5、10 μL的譜圖，結(jié)果表明,進(jìn)樣體積為2 μL時(shí)峰形良好，加之進(jìn)樣體積減少也可以降低基質(zhì)的流出，減少因基質(zhì)效應(yīng)造成的干擾。故本試驗(yàn)選擇進(jìn)樣體積為2 μL。

2.3 提取溶劑的選擇

試驗(yàn)對比了提取時(shí)長為30 min時(shí)，提取溶劑分別為水、50%(體積分?jǐn)?shù))的甲醇及80%(體積分?jǐn)?shù))的甲醇的提取效果。結(jié)果表明,以上各溶劑對目標(biāo)物的提取效果并無顯著差別。最終選擇經(jīng)濟(jì)且易得的水作為提取溶劑。

2.4 提取時(shí)間的選擇

用水作為提取溶劑，試驗(yàn)分別考察了提取時(shí)間為15、30、45 min對提取效率的影響。結(jié)果表明,提取時(shí)間達(dá)到30 min時(shí)較提取時(shí)間為15 min時(shí)，各目標(biāo)化合物含量均有5%～20%的增加。但提取時(shí)間進(jìn)一步延長，達(dá)到 45 min時(shí)，與30 min時(shí)相比已無顯著性差異。最終選擇樣品的提取時(shí)間為30 min。

2.5 線性關(guān)系及檢出限

按照選定方法，對混合氨基酸標(biāo)液進(jìn)行測定，做出工作曲線，以信噪比S/N=3時(shí)對應(yīng)的目標(biāo)化合物量為此方法該化合物的檢出限，信噪比S/N=10時(shí)對應(yīng)的目標(biāo)化合物量為此方法該化合物的定量限，各氨基酸的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限見表3。結(jié)果表明，所測18種氨基酸具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r值都大于0.995。

2.6 回收率及精密度

按選定方法對樣品(涪城麥冬)進(jìn)行了3個(gè)水平的(n=6)加標(biāo)回收，添加水平及結(jié)果見表4。結(jié)果表明，18種氨基酸回收率在81.7%～114.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于4.0%，證實(shí)該方法具有良好的準(zhǔn)確度和重復(fù)性。

表3 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限Table 3 Linear ranges,regression equations, correlation coefficients, LODs and LOQs of amino acid mixture standards

表4 回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Table 4 Results of recovery test(n=6)

續(xù)表4

2.7 樣品的測定

取10批樣品，以水為溶劑，提取30 min，作為供試品溶液。用選定方法進(jìn)行含量測定，外標(biāo)法定量，測定結(jié)果見表5。結(jié)果表明，不同批次樣品的不同氨基酸含量有顯著差異，但總體表現(xiàn)為所測氨基酸含量呈現(xiàn)整體偏低或整體偏高的現(xiàn)象，為提高麥冬的種植技術(shù)及改進(jìn)種植條件的研究提供了一定的支持。

表5 樣品中氨基酸的含量 單位：mg/kg

3 結(jié)論

本試驗(yàn)建立了涪城麥冬中氨基酸的HILIC-MS/MS檢測方法，樣品經(jīng)水超聲提取，選用Poroshell 120 HILIC-Z親水作用色譜柱，用乙腈-10 mmol/L乙酸銨溶液(含甲酸0.05%)作流動(dòng)相，采用梯度洗脫，用正離子模式多反應(yīng)監(jiān)測掃描，測定樣品中氨基酸含量。該含量測定方法提取簡單，測試靈敏度高、重復(fù)性好，能有效地滿足涪城麥冬中多種氨基酸的同時(shí)測定。