張秋月，王 剛，陳坤朋，潘道東,,*，曾小群，吳 振，郭宇星

（1.寧波大學食品與藥學學院，浙江省動物蛋白食品精深加工技術重點實驗室，浙江 寧波 315211；2.南京師范大學食品與制藥工程學院，江蘇 南京 210097）

益生菌被定義為當宿主攝入一定的量時，能通過調節(jié)腸道菌群的平衡來維持宿主消化系統(tǒng)和腸道健康的一類活的微生物[1-2]。近年來，有關益生菌的特性、功能和對人體益生作用的研究和應用逐漸增多[3]。乳酸菌作為一種益生菌，對一些人類疾病如腸功能障礙、炎癥性腸病和結腸癌等起到預防和治療效果[4]，其對人體免疫系統(tǒng)的調節(jié)作用也備受關注。

乳酸菌通過對宿主黏膜和腸上皮細胞的黏附定植在腸道中，并刺激機體的免疫系統(tǒng)[5]，通過調節(jié)細胞因子和趨化因子的產(chǎn)生來增強宿主的免疫能力[6]。目前體外實驗用腸道細胞模型來模擬人體腸上皮細胞的免疫效應，是一種有效的實驗方法，常用的細胞有人結腸癌HT-29、Caco-2、Lovo等。黃怡等[7]用乳酸乳球菌和屎腸球菌分別與Caco-2細胞共同培養(yǎng)1 h，再分別與大腸桿菌K882孵育培養(yǎng)2 h，結果發(fā)現(xiàn)這兩株乳酸菌可以通過抑制促炎因子增殖誘導配體的分泌，促進抗炎因子白細胞介素（interleukin，IL）-10的產(chǎn)生，來減弱Caco-2細胞對大腸桿菌的炎癥應答，表現(xiàn)出抗炎作用。Lin Qiuye等[8]先用瑞士乳桿菌R0052和嗜熱鏈球菌R0083發(fā)酵的大豆發(fā)酵液處理HT-29細胞16 h，再加入腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）孵育培養(yǎng)3 h，結果發(fā)現(xiàn)40 個促炎基因中有33 個基因下調，該發(fā)酵液可以通過減弱編碼多種促炎因子基因的表達來發(fā)揮免疫調節(jié)的作用。對腸上皮細胞黏附能力強的乳酸菌，延長了其在胃腸道的駐留時間，促進了其與宿主的相互作用，使其在胃腸道環(huán)境中擁有競爭優(yōu)勢[9]，有利于其發(fā)揮益生特性。Garriga等[10]發(fā)現(xiàn)腸道菌株鼠李糖乳桿菌CTC1679能通過置換作用抑制單核增生李斯特菌對HT-29細胞的黏附，維持腸道的健康。丙酸桿菌Q4能抑制大腸桿菌C3和腸炎沙門氏菌90/390對HT-29細胞的黏附，可用于開發(fā)含有丙酸桿菌的功能性食品，有助于抵抗腸道病原體的感染[11]。

嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）作為一種具有良好特性的益生菌，已被報道具有提高動物生產(chǎn)性能和增強免疫反應的作用[12-14]。Fallingborg[15]研究了健康人體的胃腸道pH值，小腸和大腸的pH值分別在4.92～7.52和5.60～8.66之間，證明L. acidophilus可以通過胃部酸性環(huán)境進入小腸[16]，同時王剛等[17]報道了pH 5.5～7.5培養(yǎng)條件下L. acidophilus的黏附特性，結果表明pH 5.5和pH 7.5條件下培養(yǎng)的L. acidophilus的黏蛋白黏附特性和細胞黏附特性均存在顯著性差異。在pH 5.5和pH 7.5的弱酸、弱堿性腸道環(huán)境中，L. acidophilus能否促進腸上皮細胞的免疫效應還是未知，哪種腸道環(huán)境對L. acidophilus調節(jié)腸道免疫更有利，其調節(jié)機制還有待研究。基于上述問題，本實驗將pH 5.5和pH 7.5培養(yǎng)條件下的L. acidophilus與HT-29細胞共同培養(yǎng)，初步探討在類似腸道的弱酸、弱堿性條件下，具有顯著性黏附差異的L. acidophilus對腸道細胞的免疫影響，以期為今后研究L. acidophilus和不同黏附特性的乳酸菌對腸道細胞的免疫調節(jié)及維持腸道健康機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Lactobacillus acidophilusATCC 4356購自中國科學院菌種保藏中心；HT-29細胞購自中國科學院上海細胞庫。

McCoy’s 5A培養(yǎng)基 上海源培生物科技股份有限公司；胎牛血清 上海依科賽生物制品有限公司；青鏈霉素混合液 上海碧云天生物技術有限公司；質量分數(shù)0.25%胰蛋白酶溶液-乙二胺四乙酸 美國Life Technologies公司；pH 7.2～7.4、10 mmol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS） 北京酷來搏科技有限公司；細胞總RNA提取試劑盒 美國Omega公司；目的基因及內參基因引物 上海英濰捷基貿易有限公司；DNA Marker、反轉錄聚合酶鏈式反應（reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒、反轉錄實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-quantitative real-time PCR，RT-qPCR）試劑盒 北京全式金生物技術有限公司；IL-8、IL-10、TNF-α酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 杭州聯(lián)科生物技術股份有限公司。

1.2 儀器與設備

M200 Pro型酶標儀 瑞士Tecan公司；IX53型倒置式熒光顯微鏡 日本Olympus公司；MCO-18AIC型CO2培養(yǎng)箱 日本Sanyo電機株式會社；Thermal Cycler型PCR儀 美國萊伯特公司；Universal Hood II型凝膠成像分析系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；超微量分光光度計上海依科賽生物制品有限公司；Light Cycler 96型熒光定量PCR儀 瑞士Roche公司；5415R型臺式高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 HT-29細胞的培養(yǎng)

將在液氮中保存的HT-29細胞取出，37 ℃水浴迅速解凍復蘇，在培養(yǎng)皿中加入現(xiàn)配的含有雙抗（青鏈霉素混合液1×）和胎牛血清的McCoy’s 5A細胞培養(yǎng)基，5%（體積分數(shù)，下同）的CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)4 h，觀察細胞貼壁狀況，待細胞長滿培養(yǎng)皿底面積的80%后，將細胞用質量分數(shù)0.25%的胰酶消化處理，并轉移到6 孔培養(yǎng)板中，連續(xù)培養(yǎng)至細胞長滿培養(yǎng)板底面積的90%以上時進行L. acidophilus的干預實驗，干預實驗過程中使用生長活力較好的對數(shù)期細胞。

1.3.2L. acidophilus的培養(yǎng)

將L. acidophilus在50 mL MRS肉湯培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)7 h后，按體積分數(shù)2%的接種量分別接種到初始pH值為5.5和7.5的100 mL MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)10 h，6 000 r/min離心10 min，棄上清液。菌體用無菌PBS清洗3 次，最終調整菌液OD600nm＝1.0（約109CFU/mL）。取2 mL均勻后的菌液，10 000 r/min離心1 min，棄上清液，加入等體積的無雙抗細胞培養(yǎng)液，4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3L. acidophilus與HT-29細胞的共培養(yǎng)

空白對照組：在6 孔細胞培養(yǎng)皿中加入2 mL無雙抗細胞培養(yǎng)液。

實驗處理組：在6 孔細胞培養(yǎng)皿中分別加入2 mL含有pH 5.5和pH 7.5的L. acidophilus細胞培養(yǎng)液。均置于5%的CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)3 h。

1.3.4 HT-29細胞總RNA的提取與瓊脂糖凝膠電泳的測定

用無菌PBS多次洗滌6 孔培養(yǎng)板中的HT-29細胞，去除L. acidophilus，按照細胞總RNA提取試劑盒的操作說明，向6 孔培養(yǎng)板中加入裂解液，吹打，以充分裂解細胞，隨后加入等體積的70%（體積分數(shù)，下同）乙醇，將混合物轉移到離心柱中，室溫10 000×g離心60 s，棄掉流出液，向離心柱中加入RNA緩沖液I，10 000×g離心60 s，棄掉流出液。向離心柱中央加入無RNA的核酸內切酶消化液，室溫（25～30 ℃）放置15 min，重復加入RNA緩沖液I，10 000×g離心60 s，棄掉流出液。向離心柱中央加入RNA緩沖液II，10 000×g離心60 s，棄掉流出液，并重復一次。將離心柱轉入一個新的1.5 mL無RNA酶的離心管中，并向離心柱中央加入預熱的DEPC水10 000×g離心60 s，洗脫RNA。在-80 ℃保存?zhèn)溆?。將提取的細胞總RNA進行2%瓊脂糖凝膠電泳，同時測定提取的細胞總RNA的濃度，確定RNA的純度是否符合下一步的實驗要求（具有清晰且單一的條帶）。

1.3.5 ELISA實驗

將6 孔培養(yǎng)板中的細胞培養(yǎng)上清液10 000×g離心1 min，取上清液分裝到無酶PE管中，液氮淬滅后于-80 ℃下貯存待測樣品。樣品檢測前于4 ℃解凍，實驗中應避免樣品反復凍融。

1.3.6 HT-29細胞免疫因子的基因相對表達量測定

反轉錄按照RT-PCR說明書進行。實驗細胞總RNA為1 000 ng，反轉錄體系組分包括5×TransScript?All-in-One SuperMix for qPCR 10 μL、gDNA去除劑2.5 μL，以無RNA酶水補足50 μL。

將各組分混勻置于PCR儀中，參數(shù)設置為：42 ℃、15 min，85 ℃、5 s，使TransScript?RT/RI和gDNA去除劑失活，迅速將cDNA于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

在NCBI及UniProt數(shù)據(jù)庫中獲得目的基因和內參基因的基因序列，利用Primer 5.0軟件設計相應引物，RT-PCR引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 Primer sequences used for RT-qPCR

加入1 μL cDNA模板，將各目的基因和內參基因GAPDH同時擴增，使用qPCR儀，RT-qPCR體系組分包括模板cDNA 1 μL、10 μmol/μL正向及反向引物各0.4 μL、2×TransStart?Top/Tip Green qPCR Super Mix 10 μL，以ddH2O補足20 μL。加樣后進行RT-qPCR擴增反應，擴增參數(shù)為：預變性94 ℃、30 s，循環(huán)一次；變性94 ℃、5 s，退火60 ℃、30 s，循環(huán)45 次。在60 ℃退火30 s時采集熒光值，熔解曲線分析步驟為：變性95 ℃、10 s，退火65 ℃、60 s，變性97 ℃、1 s，循環(huán)一次。冷卻階段參數(shù)為：37 ℃保溫600 s，不采集熒光值。以GAPDH基因為內參基因，采用2-ΔΔCt法計算實驗處理組相對于空白對照組HT-29細胞各免疫因子基因的相對表達量。

1.3.7 HT-29細胞免疫因子質量濃度測定

將IL-8、IL-10、TNF-α標準品按免疫因子標準品說明書梯度稀釋，細胞培養(yǎng)基作為各個標準曲線的零濃度。具體步驟按照ELISA試劑盒說明書進行操作，反應結束后迅速用酶標儀測定在450 nm和570 nm波長處的OD值，OD值的校準用OD450nm-OD570nm表示。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實驗設置3 組平行，數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，采用SAS V8軟件完成統(tǒng)計分析，并利用Origin 8.5軟件繪圖。差異顯著性比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 HT-29細胞RNA瓊脂糖凝膠電泳分析結果

為確定提取的HT-29細胞總RNA的質量，對提取的RNA進行2%的瓊脂糖凝膠電泳（圖1），HT-29細胞的28S RNA和18S RNA條帶較為清晰且單一，表明提取的RNA純度較高，可用于后期實驗。

圖1 HT-29細胞RNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 1 Agarose gel electrophoresis analysis of total RNA extracted from HT-29 cells

2.2 HT-29細胞免疫因子基因相對表達量測定結果

圖2 3 組HT-29細胞免疫因子基因相對表達量Fig. 2 Relative gene expression levels of immune factors in HT-29 cells from three groups

如圖2 所示，與空白對照組相比，實驗處理組H s p 7 0 和T N F-α 基因的相對表達量極顯著上調（P＜0.01），IL-8、NF-κB和TLR-4基因的相對表達量極顯著下調（P＜0.01），表明在共培養(yǎng)過程中L. acidophilus的加入對HT-29細胞產(chǎn)生了顯著的免疫刺激，通過產(chǎn)生各種細胞因子，引起腸黏膜系統(tǒng)的先天性免疫和獲得性免疫反應。IL-8是一種促炎趨化因子，在正常生理條件下，上皮細胞在受到感染或組織損傷時會產(chǎn)生IL-8，IL-8可誘導中性粒細胞向受感染部位趨化，通過誘導吞噬作用、氧化爆發(fā)來降低感染的幾率[18]。處理組中HT-29細胞IL-8基因的相對表達量極顯著下調（P＜0.01），表明L. acidophilus能降低HT-29細胞感染和組織損傷的程度，對腸上皮細胞起到一定的保護作用。

與空白對照組相比，實驗處理組在p H 5.5 條件下Hsp70和TNF-α基因的相對表達量極顯著上調（P＜0.01），分別是空白對照組的1.54 倍和11.9 倍，IL-8、NF-κB和TLR-4基因的相對表達量極顯著下調（P＜0.01），分別是空白對照組的0.11、0.33 倍和0.86 倍，IL-10基因的相對表達量呈現(xiàn)上調的趨勢，但與空白對照組相比無顯著性差異（P＞0.05）。大量研究表明Hsp，特別是保守的Hsp70，能夠激活免疫反應，在調節(jié)先天免疫應答中起著重要作用。Lan Cheng等[19]研究表明Hsp70可以改善小鼠感染性腸易激綜合征的副反應和腸蠕動異常，通過促進抑炎因子IL-10的產(chǎn)生提高小鼠的腸道免疫力。本實驗也得到了相似的結果，HT-29細胞經(jīng)pH 5.5培養(yǎng)的L. acidophilus刺激后，Hsp70基因的相對表達量極顯著上調（P＜0.01），同時IL-10基因的相對表達量呈現(xiàn)上升的趨勢，表明弱酸條件下的L. acidophilus能提高腸道細胞抵抗外界不良環(huán)境的能力，維護腸道健康。

用pH 7.5條件下培養(yǎng)的L. acidophilus和HT-29細胞共同培養(yǎng)，Hsp70、IL-8、IL-10、NF-κB、TLR-4和TNF-α基因的相對表達量分別是空白對照組細胞的2.02、0.06、14.70、0.19、0.46 倍和24.9 倍，均與空白對照組存在顯著性差異（P＜0.05）。NF-κB通路是一個典型的炎癥信號通路，可被TLR-4激活，促進促炎細胞因子的表達，引發(fā)強直性脊柱炎等多種疾病[20]。TLRs是對抗病原體的第一道防線，可誘導機體對受損組織自身產(chǎn)生的抗原產(chǎn)生免疫反應，從而導致許多自身免疫性和炎性疾病[21]。目前主要利用小分子的拮抗劑選擇性地與TLRs結合，抑制TLRs信號的轉導，逆轉TLRs在自身免疫性和炎性疾病中的破壞作用[22]。T L R-N F-κ B 是一個典型的炎癥通路，T L R 可通過下游的信號分子如髓樣分化因子8 8（m y e l o i d differentiation factor 88，MyD88）激活NF-κB通路，本研究表明HT-29細胞與pH 7.5條件下的L. acidophilus共同培養(yǎng)后，NF-κB和TLR4基因的相對表達量極顯著降低（P＜0.01），減少了整個TLR-NF-κB炎癥信號轉導過程的產(chǎn)物，有利于保護腸道細胞免受自身免疫反應和炎癥性疾病的影響[21]。

HT-29細胞與pH 7.5實驗處理組的L. acidophilus共同培養(yǎng)后，Hsp70、IL-10和TNF-α基因的相對表達量極顯著高于p H 5.5 實驗處理組（P＜0.01），同時N F-κ B 和T L R 4 基因的相對表達量極顯著下調（P＜0.01）。對腸上皮細胞的黏附能力是評價菌株益生性的重要指標，有研究表明Lactobacillus casei CRL431與Lactobacillus paracasei CNCMI-1518可通過TLRs黏附于腸上皮細胞，并刺激相關免疫細胞引起細胞因子IL-6和巨噬細胞趨化蛋白1增加，從而引起機體的先天免疫應答[23]。Zhou Mingxu等[24]用甲基-β-環(huán)糊精去除Caco-2和IPEC細胞的膽固醇，可明顯減少大腸桿菌和沙門氏菌對腸上皮細胞的黏附和侵襲，并且降低了純化重組大腸桿菌鞭毛蛋白激活腸上皮細胞TLR-5信號的能力。Reti等[25]研究表明空腸彎曲桿菌可顯著提高大腸桿菌HB101對T84細胞的黏附，同時下調T84細胞TLR-4基因的表達，上調IL-8基因的表達。Wu Zhen等[26]對L. acidophilus在類似腸道的pH值環(huán)境中生長時的黏附活性進行了蛋白組學分析，發(fā)現(xiàn)pH 5.5和pH 7.5組的黏附相關表面蛋白PrtP和FmtB的表達上調，且差異蛋白數(shù)高達207 個。在以上研究的基礎上，本實驗結果表明弱堿條件下黏附能力強的L. acidophilus對上皮細胞免疫因子的產(chǎn)生具有顯著性的影響，通過減少TLR-NF-κB炎癥信號的轉導，促進抗炎因子IL-10的產(chǎn)生，更利于L. acidophilus發(fā)揮腸道益生作用，提高腸道的免疫力。

2.3 HT-29細胞免疫因子的質量濃度測定結果

如表2所示，IL-8在空白對照組中質量濃度極顯著高于實驗處理組（P＜0.01）。在實驗處理組中，pH 5.5處理組IL-8的質量濃度低于pH 7.5處理組，但兩組之間并無顯著性差異（P＞0.05），其差異分析的結果與IL-8基因轉錄水平測定結果具有一致性。研究表明IL-8與多種炎癥性疾病和腫瘤的發(fā)展密切相關，目前臨床上開發(fā)的相關受體抑制劑對相關疾病有明顯的治療作用[27]。實驗結果表明L. acidophilus的加入，可極顯著提高腸道細胞抵抗炎癥性疾病和腫瘤的免疫能力（P＜0.01）。

表2 不同處理組HT-29細胞免疫因子的質量濃度Table 2 Concentrations of immune factors in HT-29 cells

IL-10在實驗處理組中的質量濃度極顯著高于空白對照組（P＜0.01）且pH 7.5處理組相對于pH 5.5處理組，IL-10的質量濃度極顯著增加（P＜0.01），和IL-10基因轉錄水平結果一致。IL-10是一種有效的抗炎細胞因子，對保護宿主免受過度炎癥和免疫反應至關重要。人類遺傳學研究也證實了IL-10對預防腸道內的有害炎癥發(fā)揮著重要的作用[28]。Xiao Zuoxiang等[29]研究表明IL-10可保護小鼠胰島細胞免受致糖尿病T細胞的侵襲。動物腸道中巨噬細胞IL-10受體（IL-10Rα）的表達缺失后，易引發(fā)自發(fā)性的潰瘍性結腸炎[30]。實驗結果表明弱堿條件下（pH 7.5）培養(yǎng)的L. acidophilus能極顯著提高HT-29細胞抗炎因子IL-10的質量濃度（P＜0.01），降低機體的腸道炎癥。

實驗處理組中TNF-α的質量濃度極顯著高于對照組（P＜0.01），pH 7.5實驗組和pH 5.5實驗組TNF-α的質量濃度無顯著性差異（P＞0.05），與TNF-α基因轉錄水平測定結果有一定偏差，可能的原因是基因的表達和翻譯過程存在時間差，或者是TNF-αmRNA水平的提高，激活了TNF-α基因表達的負調控因素，從而抑制了TNF-α的表達。TNF-α是具有多種生物學效應的細胞因子，適量的TNF-α在抵抗病原菌和腫瘤預防中起著重要的作用，當其超過一定量時可與其他炎癥因子一起促進癌癥的發(fā)生及多種病理性損傷[31]。董雨龍[32]報道，TNF-α可通過激活NF-κB信號通路和抗凋亡基因的高表達參與大鼠急性肝損傷的調節(jié)，適量質量濃度的TNF-α對急性肝損傷具有保護作用。同時Djaldetti等[33]研究發(fā)現(xiàn)益生菌能促進人類外周血單核細胞分泌TNF-α、IL-1β、IL-6和干擾素γ，其中TNF-α質量濃度達1.81 ng/mL，同時降低脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）對細胞的炎癥反應。Hu Naihua等[34]利用LPS建立人肝星狀細胞炎癥模型，研究連翹脂素的炎癥干預效果，結果表明連翹脂素能通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路降低LPS的促炎反應，TNF-α的質量濃度降至約為80 pg/mL。本實驗結果表明在添加L. acidophilus以后，細胞因子TNF-α在轉錄水平和蛋白相對表達水平均極顯著提高（P＜0.01），質量濃度達47.21 pg/mL。TNF-α能通過激活NF-κB信號通路，引發(fā)腸道炎癥，實驗結果顯示TNF-α、TLR-4和NF-κB的基因相對表達量未出現(xiàn)同步變化，可能的原因是L. acidophilus對腸道細胞TNF-α質量濃度的提高主要是增強腸道細胞的免疫活性，不會引起腸道的炎癥疾病。

3 結 論

本實驗對具有黏附性差異的L. acidophilus對腸道細胞免疫因子的影響做了初步分析，表明L. acidophilus在正常腸道弱堿性環(huán)境（pH 7.5）中黏附性較強，能夠抑制腸道細胞炎癥因子IL-8的表達，同時促進抗炎因子IL-10的表達，顯著降低腸道細胞的炎癥反應。此外NF-κB、TLR-4、Hsp70基因相對表達量的改變也均會對腸道產(chǎn)生有利的影響。整體來看，在正常的弱堿性腸道環(huán)境中L. acidophilus可提高腸道細胞的抗炎能力。