焦健

摘 要：本研究通過分離純化獲得一種新的黃曲霉真菌病毒，并對該真菌病毒的基本基因組序列信息進行比對分析，研究帶毒菌株的生長狀況及其后代中黃曲霉毒素B1（AFB1）的產(chǎn)生情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該真菌病毒不但可以影響黃曲霉菌的生長，而且還可以影響AFB1的產(chǎn)生。

關(guān)鍵詞：真菌;真菌病毒;真菌毒素;抑制作用

中圖分類號：S-3 ? ? ? 文獻標(biāo)識碼：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20200930004

引言

真菌病毒（Fungal virus或Mycovirus）是侵染真菌并在真菌中復(fù)制的病毒，普遍存在于自然界中。目前所發(fā)現(xiàn)的真菌病毒多數(shù)屬于RNA病毒，但在核盤菌中曾報道一種DNA病毒，即SsHADV-1。大多數(shù)病毒感染真菌后不表現(xiàn)感染特征，對寄主沒有顯著影響，常不易發(fā)現(xiàn);但也有一些真菌病毒對寄主的表型具有顯著的抑制作用，如引起植物病菌真菌致病力衰退現(xiàn)象。目前，在已發(fā)現(xiàn)的弱毒力真菌病毒中已有部分進行了序列分析，如RnMBV1、CHV1、RVM2、DPRV、FgV-1、HvV190S、SsDRV和SsHADV-1。這些真菌病毒為植物真菌病害的防治及病原真菌的分子生物學(xué)特性研究提供了新的契機。

目前所發(fā)現(xiàn)的真菌病毒多為RNA病毒，根據(jù)其基因組類型分為雙鏈RNA（dsRNA）病毒和單鏈RNA（ssRNA）病毒，也有一些dsDNA病毒。根據(jù)核酸類型、病毒粒體有無、病毒粒體形狀等分類依據(jù)，可將目前發(fā)現(xiàn)的dsRNA真菌病毒分為黃綠病毒科、雙分病毒科、呼腸孤病毒科、全病毒科和低毒病毒科等;而ss（+）RNA真菌病毒分別歸屬于桿菌狀核糖核酸病毒科和裸露病毒科等，分布于寄主線粒體中的病毒稱之為線粒體病毒（Mitovirus）。

植物真菌病害會對農(nóng)作物的產(chǎn)量及品質(zhì)造成嚴(yán)重影響，而且在作物生長和糧油產(chǎn)品儲藏過程中，可分泌多種對人畜有害的代謝物，對農(nóng)產(chǎn)品的產(chǎn)量及安全都造成了一定程度危害。目前，農(nóng)作物真菌病害主要依賴化學(xué)防治，這種方法不可避免地會產(chǎn)生環(huán)境污染及農(nóng)藥殘留等問題。所以，生物防治因其對環(huán)境的友好性而備受關(guān)注，真菌病毒可作為防控病原真菌的生物防治途徑之一。目前研究發(fā)現(xiàn)，致病力衰退相關(guān)的真菌病毒可用于植物病害的生物防治，其中低毒病毒（Hypovirus）與板栗疫病病菌（Cryhonectria parasitica）的互作系統(tǒng)是真菌病毒與寄主互作研究的經(jīng)典模式。本研究以分離黃曲霉真菌病毒為切入點，旨在利用真菌病毒直接防控黃曲霉毒素的形成。

1 材料與方法

1.1 病毒dsRNA提取

稱取0.3g菌絲（干重），在液氮下研磨成粉，轉(zhuǎn)移至2mL離心管中。在離心管中依次加入2×GPS 500μL，苯酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）1000μL，10% SDS 115μL，室溫充分震蕩10min。4℃ 12000rpm離心8min，取上清600μL至1.5mL離心管（需事先加好纖維素粉）。在1.5mL離心管中加入0.04g左右的CF-11纖維素粉，114μL的100%乙醇（每100μL上清需加19μL100%乙醇），震蕩混勻后冰浴20～30min;4℃12000rpm離心1min，棄上清，加入600μL清洗緩沖液，震蕩混勻，室溫靜置3min，再離心、清洗2次;4℃12000rpm離心2min，棄上清，盡量不使管壁上殘留液體，然后加入640μL 1×STE，震蕩混勻5min;4℃ 12000rpm離心5min，取上清600μL至干凈的1.5mL離心管中，加入1/10體積的3M NaAC（pH5.2）和0.8～1.0倍體積的異丙醇，-20℃沉淀2h以上;4℃ 12000rpm離心20min，棄上清，用800μL預(yù)冷的75%乙醇清洗2次，再用500μL 100%乙醇清洗1次，離心棄上清，沉淀于超凈臺吹風(fēng)干燥。加入40μL DEPC水溶解備用（可用50℃水浴助溶）。

1.2 實驗試劑

Malt Extract Agar（1L）：30g Malt Extract，3g Peptone，15g Agar;2×GPS：甘氨酸15.0g，Na2HPO414.2g，NaCl35.1g，用NaOH調(diào)pH值為9.6，加DEPC處理的H2O定容至1L;10×STE：0.5 M Tris，1 M NaCl，10 mM EDTA，pH8.0，DEPC處理H2O配制;清洗緩沖液：1×STE中加入無水乙醇使乙醇終濃度為15%;TE：10mM Tris-HCl，1mM EDTA，滅菌，使用時加入RNaseA至20ng·mL-1;10×TBE：Tris 108g，硼酸55g，0.5 M EDTA 40mL加入ddH2O定容至1L;10%SDS：在900mL水中加入100g電泳級SDS，加熱至68℃助溶，加水定容至1L，分裝備用，無需滅菌;Na3PO4緩沖液（pH7.0）：1000mL中含0.2 M Na2HPO4溶液（mL）610mL，0.2 M NaH2PO4溶液（mL）390mL;Na3PO4緩沖液（pH7.4）：1000mL中含0.2M Na2HPO4溶液（mL）810mL，0.2M NaH2PO4溶液（mL）190mL。

CF-11纖維素粉為Sigma公司產(chǎn)品，其它各種化學(xué)試劑為國產(chǎn)分析純。所有離心管和槍頭都需DEPC處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃曲霉真菌病毒的分離純化和基因組序列比對

本研究首先分離真菌病毒的dsRNA，對提取的樣品（YT5）進行DNase I和SI核酸酶酶切后電泳檢測，發(fā)現(xiàn)1條大小約為1000bp的條帶。電泳樣品在經(jīng)過DNase I和SI核酸酶酶切后仍然可以看到清晰的條帶，因此可斷定其為dsRNA，即為黃曲霉真菌病毒基因組。

采用隨機引物合成cDNA，對合成的cDNA進行A-Tailing后與載體相連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑選陽性克隆進行培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，挑取含有較大插入片段的質(zhì)粒進行序列測定及分析，其長度為855bp。NCBI Blast結(jié)果顯示重組質(zhì)粒為曲霉屬真菌病毒dsRNA基因組的cDNA片段。

通過將得到的黃曲霉菌真菌病毒的氨基酸序列與其它曲霉屬真菌病毒的氨基酸序列進行比對，發(fā)現(xiàn)本研究中黃曲霉菌真菌病毒的氨基酸序列與已公布的黃曲霉菌真菌病毒及臭曲霉真菌病毒的氨基酸序列存在較高的保守型，其序列同源性約為34.88%。系統(tǒng)進化樹分析表明，本研究中黃曲霉菌真菌病毒的氨基酸序列與已公布的黃曲霉菌真菌病毒178a和178b的氨基酸序列保守型約為46%。

2.2 真菌病毒對黃曲霉菌生長及其產(chǎn)毒的影響

研究真菌病毒對黃曲霉菌生長速度的影響，對帶毒菌株與不帶毒菌株生長速度測定數(shù)據(jù)顯示，帶毒菌株較不帶毒菌株生長速度更為緩慢，通過對生長1d、3d、5d和7d后的菌斑直徑的測量，帶毒菌株較不帶毒菌株的菌斑直徑明顯變?。▓D1、圖2）。

通過檢測AFB1的產(chǎn)生，發(fā)現(xiàn)攜帶dsRNA真菌病毒的后代中，AFB1的產(chǎn)量明顯下降（圖3）。這些證據(jù)表明，真菌病毒不但可以影響黃曲霉菌的生長，而且還可以影響其AFB1的產(chǎn)生。

2.3 低毒力菌株在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的防控應(yīng)用效果

利用攜帶真菌病毒的低毒力菌株或者弱毒力菌株，可以有效抑制正常菌株的生長，從而降低感染農(nóng)作物的菌株的繁殖、擴增以及其所分泌的真菌毒素的影響。為此，先分離后代中帶有真菌病毒的低毒力菌株，以便后續(xù)開展實際的生物防控應(yīng)用。

本研究通過帶毒菌株病毒的垂直傳染分析，采用單孢子分離的方法，隨機挑選帶毒菌株后代100個單孢子進行病毒dsRNA檢測。結(jié)果表明，后代中含病毒的有76個（76%），不含病毒的有24個（24%），且出現(xiàn)分化，通過檢查黃曲霉毒素產(chǎn)生量，發(fā)現(xiàn)后代帶毒菌株的AFB1明顯低于不帶毒菌株。

此外，還開展了帶毒菌株與不帶毒菌株的菌絲融合實驗。通過對比培養(yǎng)帶毒菌株與不帶毒菌株，發(fā)現(xiàn)帶毒菌株與不帶毒菌株的菌絲不能隨著生長而融合，出現(xiàn)了營養(yǎng)不親和現(xiàn)象，而且?guī)Ф揪甑纳L速度和菌絲生產(chǎn)量明顯高于不帶毒菌株（圖4），可為低毒力菌株在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的防控應(yīng)用提供基礎(chǔ)。通過選取低毒力菌株與農(nóng)田中（土壤和花生植株）實際取得的樣本菌株（均經(jīng)檢測選取產(chǎn)毒素菌株）進行聯(lián)合對峙培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)約有83%的對峙培養(yǎng)實驗表現(xiàn)出帶毒菌株的生長速度和菌絲生產(chǎn)量明顯高實際菌株，表現(xiàn)出很好的生物防控應(yīng)用效果。

3 結(jié)語

真菌病毒是指寄生于各種真菌中的病毒，其中部分弱毒相關(guān)病毒可使寄主真菌致病力發(fā)生衰退，甚至導(dǎo)致病原群體致病力下降，是一種具有生防潛能的微生物資源。真菌病毒未來的研究方向可從以下方面著手：采用宏轉(zhuǎn)錄組等技術(shù)鑒定和發(fā)掘更多的真菌病毒;通過遺傳轉(zhuǎn)化手段或挖掘可利用的化學(xué)物質(zhì)或傳播介體提高病毒的傳播效率;建立遺傳轉(zhuǎn)化體系及病毒反向遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，結(jié)合多組學(xué)手段深入研究病毒與寄主真菌互作[1]。

利用植物病原真菌病毒進行植物真菌性病害的生物防治應(yīng)用，可以從產(chǎn)生低毒力的菌株、代謝物致死植物病原真菌及其保護作用3個方面考慮。在利用真菌病毒防治植物真菌病害方面，最經(jīng)典的是通過寄生板栗疫病菌的弱毒相關(guān)真菌病毒防治歐洲板栗疫病的蔓延，是弱毒相關(guān)真菌病毒在生物防治應(yīng)用上的成功例證。然而，由于真菌病毒通常缺少細胞外的傳播途徑，只能通過孢子釋放進行垂直傳播或通過感染菌株與未感染菌株間的菌絲融合進行水平傳播，營養(yǎng)體不親和性成為限制弱毒相關(guān)病毒傳播和生物防治效率的最主要因素。在多種植物病原真菌中發(fā)現(xiàn)新的真菌病毒，這些弱毒性的真菌病毒為防治作物真菌病害提供了可能，以期通過研究者的不懈努力獲得毒性低、親和性范圍廣、傳遞低毒性強并且能適應(yīng)自然的工程菌株[2]。

本研究分離得到一種黃曲霉真菌病毒，并通過初步試驗發(fā)現(xiàn)，利用該真菌病毒可有效抑制黃曲霉毒素的形成。并且，通過低毒力菌株與農(nóng)田中樣本菌株的聯(lián)合對峙培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)帶毒菌株的生長速度和菌絲生產(chǎn)量明顯高于實際菌株，表現(xiàn)出很好的實際生物防控應(yīng)用效果。

參考文獻

[1] 李春霞，李敏，高兆銀，弓德強，洪小雨，姜瑛，常圣鑫，胡美姣.刺盤孢菌真菌病毒研究進展[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，2020，51（01）：123-132.

[2]劉忱，皮磊，舒燦偉，周而勛.低毒真菌病毒在植物病害生物防治中的研究及應(yīng)用進展[J].分子植物育種，2018，16（02）：552-559.

（責(zé)任編輯 ?周康）