歐珠朗杰 賀凱 米瑪潘多
摘 要:以梭砂貝母鱗莖為外植體,研究梭砂貝母組織培養(yǎng)中植物不同生長調(diào)節(jié)劑種類和濃度組合、外植體不同消毒方式及培養(yǎng)基蔗糖濃度對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)結(jié)果比較。結(jié)果表明,適宜誘導(dǎo)梭砂貝母鱗莖的植物生長調(diào)節(jié)劑組合及濃度為6-BA 0.5mg·L-1加NAA 3.0mg·L-1的MS培養(yǎng)基,用75%的乙醇消毒外植體30s,再用0.1%的升汞消毒10min污染率較低,蔗糖濃度為3%時(shí),愈傷組織誘導(dǎo)率較高,結(jié)構(gòu)結(jié)實(shí)、顏色淡黃且褐化率低。
關(guān)鍵詞:梭砂貝母;外植體;愈傷組織;植物生長調(diào)節(jié)劑
中圖分類號(hào):S-3 ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A
DOI:10.19754/j.nyyjs.20200930007
引言
梭砂貝母(Fritillaria delavayi Franch.)屬百合科(Liliaceae)貝母屬(Fritillaria),藏語為阿皮卡,是白合科多年生草本植物,地下鱗莖外表類白色或淺黃棕色,部分具零星棕色斑點(diǎn)[1]。在西藏海拔4100m以上的高山流石灘均有出產(chǎn),云南西北部、四川西部、青海南部(雜多、囊謙)也有出產(chǎn)。為重要的藏藥材,用于陰虛勞嗽、肺熱燥咳,干咳少痰,具有潤肺清熱,化痰功效[1]。由于梭砂貝母藥用價(jià)值高,而其生長環(huán)境特殊、分布分散,自然繁殖系數(shù)低,商品藥材完全依靠采挖野生資源并連年過度采挖,導(dǎo)致資源日趨減少,面臨枯竭危險(xiǎn),破壞了梭砂貝母生長環(huán)境、種群自然更新,使梭砂貝母資源陷入?yún)T乏。應(yīng)用植物組織培養(yǎng)技術(shù)人工擴(kuò)繁梭砂貝母資源,可不受季節(jié)、地域的影響,后代遺傳性能穩(wěn)定,具有很大的發(fā)展前景和極其重要的實(shí)際意義。目前,國內(nèi)外對(duì)梭砂貝母的研究主要集中在化學(xué)成分、藥效方面,對(duì)其栽培技術(shù)方面的研究相對(duì)較少,尚無針對(duì)梭砂貝母的較成熟組培技術(shù)參數(shù)[2]。本文通過人工條件下組織培養(yǎng)梭砂貝母,從梭砂貝母不同生長調(diào)節(jié)劑濃度及組合配比、不同消毒方式、培養(yǎng)基蔗糖濃度等方面探究梭砂貝母培養(yǎng)技術(shù)并進(jìn)行分析,得出相關(guān)技術(shù)參數(shù),提供理論依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 材料
本試驗(yàn)材料為2020年7月采集于西藏山南市扎囊縣境內(nèi),生長于海拔4650m的高山流石灘的梭砂貝母的鱗莖。從其鱗莖中選取無病害乳白色鱗莖進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室無菌處理,將切成適宜大小的鱗莖小塊,接種于不同濃度植物生長調(diào)節(jié)劑組合濃度的MS培養(yǎng)基上,進(jìn)行調(diào)控培養(yǎng)。
1.2 試驗(yàn)方法
1.2.1 培養(yǎng)基及母液的配制
以MS培養(yǎng)基(大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)物質(zhì))為基本培養(yǎng)基分別加入2%、3%、4%的蔗糖和7g·L-1的瓊脂,pH值調(diào)至5.8,攪拌均勻,添加不同濃度的2, 4-D,6-芐基氨基嘌呤(6-BA)、萘乙酸(NAA)激素,分裝于培養(yǎng)瓶。
2, 4-D、萘乙酸(NAA)、6-芐基嘌呤(6-BA)等植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì),分別配成母液(0.1mg·mL-1)。配制方法:分別稱取2, 4-D、6-BA和NAA各10mg,將NAA用少量(1mL)無水乙醇預(yù)溶,將6-BA用少量(1mL)物質(zhì)的量濃度為0.1mol·L-1的NaOH溶液溶解,溶解過程需要水浴加熱,最后分別定容至100mL,即得質(zhì)量濃度為0.1mg·mL-1的母液[3]。
1.2.2 外植體的處理
組培用梭砂貝母鱗莖取自自然生境,外植體內(nèi)外附有大量的微生物,外植體能否有效消毒是組織培養(yǎng)成功與否的重要影響因素[4]。消毒要求把材料表面和組織內(nèi)的各種微生物殺滅干凈,只輕微損傷甚至不損傷組織材料而達(dá)到不影響外植體組織活力的目的[4]。
選取梭砂貝母地下鱗莖先用流水沖洗1h以上,根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行3種不同的消毒方式(表1),用無菌水沖洗3次,再用無菌濾紙將外植體表面的水吸干,將其切成0.5cm,厚度為0.2cm左右大小相近的小塊,接種到培養(yǎng)基上。
1.2.3 愈傷組織的誘導(dǎo)
根據(jù)外植體消毒處理結(jié)果,選擇消毒效果良好的消毒方法,將梭砂貝母適宜大小鱗莖小塊接種在附加不同濃度AA、2, 4-D、BA組合及不同濃度蔗糖培養(yǎng)基上,設(shè)蔗糖濃度為2%、3%、4%的培養(yǎng)基,比較蔗糖和植物生長調(diào)節(jié)劑濃度組合對(duì)梭砂貝母愈傷組織生長的影響[5]。
2 結(jié)果與分析
2.1 不同消毒方法對(duì)外植體污染的影響
從表1可以看出,僅用75%乙醇消毒30s的外植體污染率最高;75%乙醇消毒30s,再用0.1%的升汞消毒10in次之;用75乙醇消毒材料30s,再用0.1%的升汞消毒20min的外植體污染率最低。
3種消毒方法中,第1種方法污染率最高,第3種消毒方法污染率最低,但第3種消毒方法使鱗莖褐變率達(dá)90%以上。因此,第2種消毒方法較適合鱗莖的消毒。
2.2 植物生長調(diào)節(jié)劑對(duì)外植體愈傷組織誘導(dǎo)的影響
植物生長調(diào)節(jié)劑是植物組織培養(yǎng)過程中外植體脫分化形成愈傷組織的關(guān)鍵因素,形成愈傷組織的量和質(zhì)量由培養(yǎng)基中不同植物生長調(diào)節(jié)劑的相對(duì)濃度控制,而不是這些物質(zhì)的絕對(duì)濃度決定[5]。采用上述第2種消毒方法消毒的梭砂貝母鱗莖接種于附加2, 4-D,6-BA,NAA的6種培養(yǎng)基。結(jié)果(表2)表明,在6-BA 0.5mg·L-1加2, 4-D 3.0mg·L-1和MS加6-BA 0.5mg·L-1加NAA 3.0mg·L-1的MS培養(yǎng)基對(duì)鱗莖愈傷組織誘導(dǎo)率最高,均達(dá)到75%。
2.3 蔗糖濃度對(duì)外植體愈傷組織誘導(dǎo)的影響
選取相同適宜消毒方法和植物生調(diào)節(jié)劑濃度組合的培養(yǎng)基,其蔗糖濃度為3%時(shí),外植體愈傷組織誘導(dǎo)率較高(表3);蔗糖濃度為2%、2.5%、3.5%、4%時(shí),外植體的愈傷組織誘導(dǎo)率均較低;其中4%時(shí)外植體愈傷組織誘導(dǎo)率最低,可見誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基較適宜的蔗糖濃度為3%。
3 結(jié)論
在本研究中,以梭砂貝母鱗莖作為外植體,分別研究適宜誘導(dǎo)愈傷組織的外植體消毒劑濃度、培養(yǎng)基蔗糖濃度及植物生長調(diào)節(jié)劑種類和濃度組合。
通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在培養(yǎng)基中添加不同濃度的蔗糖對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)有一定程度的影響,蔗糖濃度為3%時(shí),外植體的愈傷組織誘導(dǎo)率較高;較低(2%)或較高(4%)均抑制外植體脫分化形成愈傷組織。較低或較高的蔗糖濃度使愈傷組織呈透明或淡黃色水澤狀,結(jié)構(gòu)硬板,形成量小,易褐化死亡,不利于進(jìn)一步轉(zhuǎn)接繁殖、分化和成苗[6]。誘導(dǎo)愈傷組織2種較好的培養(yǎng)基分別是MS加6-BA 0.5mg·L-1加2, 4-D 3.0mg·L-1和MS加6-BA 0.5mg·L-1加NAA 3.0mg·L-1。可為今后克服梭砂貝母組培與擴(kuò)繁試驗(yàn)的盲目性,節(jié)約人力、物力、財(cái)力提供理論依據(jù)。
參考文獻(xiàn)
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(責(zé)任編輯 ?李媛媛)