BtCry1Ac 原毒素對楊扇舟蛾幼蟲的毒力測定及 幼蟲對Bt 毒素的細胞響應

劉 潔，高寶嘉

（河北農(nóng)業(yè)大學 林學院，河北 保定 071000）

楊扇舟蛾（Clostera anachoreta） 屬 鱗 翅 目（Lepidoptera），是林木十二大害蟲之一，最新調查結果表明，楊扇舟蛾的幼蟲為害可使楊樹生長降低30%以上，嚴重危害林業(yè)和園林業(yè)的發(fā)展，近些年隨著全球氣候變暖，楊扇舟蛾的年世代有增加的趨勢，由于其繁殖速度較快、產(chǎn)卵數(shù)量較多，在河北、山東、安徽，山西等地給整個楊樹產(chǎn)業(yè)造成巨大的危害［1-3］。

BtCry1Ac 毒蛋白為蘇云金芽孢桿菌產(chǎn)生的伴孢晶體，主要作用昆蟲的中腸，科學家以煙草天蛾（Manduca sexta）作為模式昆蟲探索并提出了Bt在中腸的成孔模型［4-6］。對于一些抗性昆蟲，研究發(fā)現(xiàn)Cry1Ac 通過中腸進入其他組織，但未到達幼蟲的皮膚，且Cry1Ac 在脂肪體中降解最快，其次是血淋巴、周營養(yǎng)膜及其內容物，在中腸中代謝緩慢［7］。昆蟲取食Bt 毒素后，中腸組織會發(fā)生一系列的病理變化，具體包括柱狀細胞微絨毛的腫脹、斷裂，細胞核拉長、核仁凝聚，線粒體變形，內質網(wǎng)囊泡化并斷裂等［8-10］，最終導致腸道破裂，隨著取食時間的延長，病變由輕度向重度發(fā)展，表現(xiàn)為中腸腸壁腫厚，柱狀細胞變形被拉長，杯狀細胞數(shù)量減少等［11］，且發(fā)現(xiàn)Cry1Ac 對中場組織的破壞速度要快于Cry2Ab和Vip3Aa 等其他Bt 毒素蛋白［12-14］。最新研究還發(fā)現(xiàn)，受到Cry 脅迫后秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）轉錄因子HLH-30 能介導細胞自噬，以細胞的自主方式使秀麗隱桿線蟲的中腸上皮細胞進行防御反應［15］，使其對Bt 產(chǎn)生一定的耐受性。

本實驗室前期研究已發(fā)現(xiàn)BtCry1Ac 毒蛋白對楊扇舟蛾幼蟲具有毒殺活性，亞致死濃度Bt 的致死率隨楊扇舟蛾幼蟲世代的增加而顯著降低［16］，表明楊扇舟蛾對Bt 產(chǎn)生了一定的耐受性。因此，本研究選取亞致死濃度BtCry1Ac 原毒素，通過透射電鏡觀察楊扇舟蛾幼蟲取食毒素后的細胞結構的變化和響應，以期為進一步了解Cry1Ac 毒素的作用機制及更好地利用Bt 制劑防治楊扇舟蛾提供理論依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 材料

供試BtCry1Ac 原毒素由北京美延農(nóng)業(yè)科技有限公司提供，原濃度為3.43 mg/mL，溶解于0.05 mol/L Na2CO3溶液中。供試昆蟲楊扇舟蛾的卵及初孵幼蟲于2016 年5 月在唐山國營林場非轉基因2 年生楊樹林采集，并于河北農(nóng)業(yè)大學林學院森保實驗室室內飼養(yǎng)2 代后用于該試驗，用741 楊樹葉片飼喂。供試楊樹葉片：一年生非轉基因741 楊，種植于河北農(nóng)業(yè)大學林學院標本園。所用試劑均為國內分析純。

1.2 方法

1.2.1 BtCry1Ac 原毒素對楊扇舟蛾幼蟲的毒力測定用0.05 μmol/L 的碳酸鈉溶液稀釋BtCry1Ac 原毒素，濃度依次為17.15、8.5、1.715、0.857 5、0.171 5、 0.085 75 mg/L，以0.05 mol/L Na2CO3作為對照，共7 個處理。采用浸葉法將楊樹葉片浸于不同濃度的BtCry1Ac 溶液10 s 后，取出晾干，按需分別置于玻璃瓶中，每處理20 頭3 齡初孵幼蟲，3 組重復，250 目紗網(wǎng)封口，溫度設定為（26±1）℃，濕度控制在60%～75%，自然光周期。每天換新處理楊樹葉，各處理脅迫6 d 后統(tǒng)計幼蟲死亡情況，計算校正死亡率，校正死亡率=（處理組死亡率-對照組死亡率）/（100-對照組死亡率）×100%，并計算Bt 原毒素的LC50。以針頭觸碰蟲體，無任何反應者視為死亡，反之則為存活幼蟲

1.2.2 楊扇舟蛾中腸組織樣品處理與電鏡觀察 將楊扇舟蛾4 齡幼蟲飼喂含亞致死濃度BtCry1Ac（LC50）的楊樹葉片，在取食2 h（1B2H）、8 h（1B8H）、72 h（1B72H）時分別對試蟲進行解剖分離中腸組織，以未取食Bt 的4 齡幼蟲作為對照（1K0H），截取1 ～1.5 mm 中腸快速浸入2.5%戊二醛（GA）+ 0.1 mol/L PB 緩沖液（pH7.4），4 ℃過夜，預固定。

用0.1 mol/L PB 緩沖液洗滌2 次，每次10 min， 然 后ddH2O 洗 滌2 次，每 次10 min；將2% 鋨 酸+3%鐵氰化鉀等體積混合，加入中腸組織，4 ℃，2 h；ddH2O 洗滌3 次，每次10 min。固定好的樣品進行乙醇梯度脫水3 次，每次10 min。滲透：100%丙酮 處理10 min×2；丙酮/環(huán)氧樹脂=3/1，處理1 ～3 h ； 丙酮/ 環(huán)氧樹脂=1/1，處理3 ～5 h；丙酮/ 環(huán)氧樹脂=1/3，處理12 h 或過夜；100%環(huán)氧樹脂，每 12 h 更換新鮮樹脂，至少換2 次；100%環(huán)氧樹脂（+1.5% 加速劑）12 h 或過夜。最后用100%環(huán)氧樹脂（+1.5% 加速劑）包埋樣品，用Leica UC7 超薄切片機切片，2% 醋酸雙氧鈾UA+0.5% 檸檬酸鉛后染色，用120 kV 透射電子顯微鏡（FEI Tecnai Spirit）進行成像觀察。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)利用Excel 2007、DPS 及CraphPad Prism 8.0.1 軟件進行統(tǒng)計分析和繪圖，采用Ducan氏新復極差法進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 BtCry1Ac 原毒素對楊扇舟蛾幼蟲的毒力測定

試驗選取生長發(fā)育一致的楊扇舟蛾3 齡幼蟲進行毒力測試，6 d 后統(tǒng)計幼蟲的死亡率結果如表1。經(jīng)CraphPad Prism 8.0.1 計算，線性回歸方程為： Y = 0.051X + 0.126 4，R2= 0.945 6；LC50= 0.733 μg/mL。 在試驗中以0.75 μg/mL 作為Bt 毒素對楊扇舟蛾幼蟲的LC50。

表1 不同濃度BtCry1Ac 脅迫6 d 后的楊扇舟蛾 幼蟲死亡率Table 1 The mortality of Clostera anachoreta larvae with different concentrations of BtCry1Ac in 6 days

2.2 取食BtCry1Ac 原毒素后楊扇舟蛾幼蟲中腸細胞的變化

2.2.1 楊扇舟蛾幼蟲中腸細胞的結構的變化 楊扇舟蛾幼蟲取食亞致死濃度Bt 毒素后，其中腸組織發(fā)生一系列病理變化。如圖1 所示，取食正常葉片的對照組（1K0H）中，柱狀細胞頂端的微絨毛數(shù)量較多且排列整齊緊密，粗細和長短均一；內質網(wǎng)排列整齊呈長線狀；線粒體內背脊清晰且形狀為規(guī)則的橢圓或圓形；細胞核的核膜清晰完整，其中染色質分布均勻。幼蟲取食Bt 毒素2 h 后，其中腸微絨毛出現(xiàn)斷裂脫落情況 ；內質網(wǎng)腫脹斷裂，且排列不規(guī)則 ；線粒體內雖然背脊清晰，但已發(fā)生嚴重變形；細胞核核膜清晰但形狀不規(guī)則，染色質發(fā)生固縮。取食Bt 毒素8 h 和72 h 的幼蟲中腸結構發(fā)生嚴重病變，微絨毛數(shù)量減少失去原有形態(tài)，且發(fā)生腫脹斷裂并脫離細胞膜，在膜上散落分布；內質網(wǎng)已經(jīng)嚴重變形斷裂且發(fā)生分離；線粒體內背脊變得模糊，且嚴重變形甚至空泡化；細胞核在受到Bt 脅迫8 h后，核膜較清晰，但核內染色質發(fā)生固縮，但在72 h 時細胞核形狀拉長，且無明顯的核膜并且染色質發(fā)生固縮。

圖1 楊扇舟蛾幼蟲對BtCry1Ac 初始響應的中腸細胞結構Fig. 1 The midgut cells of C. anachoreta larva in the initial response to BtCry1Ac

2.2.2 楊扇舟蛾幼蟲中腸組織整體結構的變化 由圖2 可知，楊扇舟蛾幼蟲中腸組織未受到Bt 脅迫時，各類中腸細胞排列整齊，柱狀細胞微絨毛粗細均勻，長度統(tǒng)一；杯狀細胞為規(guī)則的橢圓形或者長橢圓形，腔內細胞質突起排列有序。幼蟲取食Bt 毒素2 h 后，視野中細胞數(shù)量增多中腸組織增厚變形，柱狀細胞微絨毛出現(xiàn)斷裂；視野中杯狀細胞數(shù)量減少，腔內出現(xiàn)游離的微絨毛，胞腔變小。當幼蟲取食Bt 毒素8 h 時，細胞數(shù)量依然較對照組多且厚，細胞上皮發(fā)生褶皺，柱狀細胞微絨毛在此圖中不清晰，見圖1，微絨毛腫脹斷裂，并脫離膜；杯狀細胞數(shù)量與對照一致，但細胞腔變小，內部微絨毛脫落。當幼蟲取食Bt 毒素72 h 時，中腸組織在視野中幾乎看不到完整的一段細胞，且細胞間發(fā)生褶皺，柱狀細胞和杯狀細胞腔內的微絨毛都發(fā)生了脫落，杯狀細胞的細胞腔變形，細胞質渾濁。

圖2 楊扇舟蛾幼蟲對BtCry1Ac 初始響應的 中腸組織整體結構Fig.2 The overall structure of midgut tissue of C. anachoreta larva in the initial response to BtCry1Ac

2.3 楊扇舟蛾幼蟲對BtCry1Ac 原毒素的細胞響應

觀察取食Bt 毒素的楊扇舟蛾幼蟲中腸細胞發(fā)現(xiàn)，其細胞內頻繁出現(xiàn)類似自噬體和吞噬體等的結構。幼蟲取食Bt 毒素2 h 后，通過電鏡檢測，觀察到了自噬或吞噬作用出現(xiàn)，圖3 中，（a）到（f）為自噬體或吞噬了細胞器的吞噬體，雙層膜結構內含細胞器，（g）（h）則為單層膜的自噬溶酶體。

取食Bt 毒素8 h 后，幼蟲中腸同樣出現(xiàn)了與2 h 相同的細胞結構，圖4 中，（a）（b）（c）為單層膜的自噬溶酶體，（d）到（g）為自噬體或吞噬體，里面清晰可見被包裹的細胞器和細胞質，（g）則是正在與溶酶體結合的自噬小體。

當楊扇舟蛾幼蟲取食Bt 毒素72 h 后，仍可在其中腸細胞內觀察到自噬體和吞噬體等結構。說明在Bt脅迫初期，楊扇舟蛾中腸細胞內被激活了自噬作用，以維持體內的正常的生命活動。圖5 中，（a）到（d） 均為具有雙層膜結構的自噬小體或吞噬體，內含多種細胞器。（e）（f）（g）則認為是正在與溶酶體進行結合的自噬體結構。（h）為單層膜的自噬溶酶體，其內部胞漿成分已降解。

圖3 楊扇舟蛾幼蟲1B2H 的中腸細胞結構Fig.3 The cell structure of the midgut of C. anachoreta larva（1B2H）

圖4 楊扇舟蛾幼蟲1B8H 的中腸細胞結構Fig.4 The cell structure of the midgut of C. anachoreta larva（1B8H）

圖5 楊扇舟蛾幼蟲1B72H 的中腸細胞結構Fig.5 The cell structure of the midgut of C. anachoreta larva（1B72H）

3 結論與討論

本試驗結果表明，BtCry1Ac 原毒素對楊扇舟蛾3 齡幼蟲的LC50為0.733 μg/mL，且亞致死濃度的Bt 毒素脅迫初期（2 h）便引起4 齡幼蟲中腸組織的病理變化，如，線粒體出現(xiàn)變形，內質網(wǎng)腫脹，染色質固縮等現(xiàn)象，隨著脅迫時間的延長，Bt對中腸組織的破壞程度加重。對二點委夜蛾幼蟲的研究發(fā)現(xiàn)，取食Cry1Ac 毒素蛋白12 h 后幼蟲中腸細胞出現(xiàn)病變，對細胞線粒體、內質網(wǎng)、細胞核的破壞程度較大［11］，這也表明楊扇舟蛾對BtCry1Ac毒素較敏感。在對玉米根蟲（Diabrotica virgifera virgifera）的研究中也發(fā)現(xiàn)，Bt 毒素（Cry34/35Ab1、Cry3Aa1、Cry6Aa1）均能使其產(chǎn)生明顯的中毒癥狀，即中腸細胞的腫脹和脫落、中腸圓形肌肉收縮、干細胞激活和中腸腔阻塞等現(xiàn)象［17］；Cry2Ab 還會使棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)中腸細胞內不同大小的溶酶體的空泡化，轉基因Bt 番茄使中腸細胞的柱狀細胞和杯狀細胞的細胞核均發(fā)生嚴重的空泡化和變性，核膜破裂成電子密集的環(huán)狀球體［18-19］。

本研究還發(fā)現(xiàn)亞致死濃度的Bt 原毒素可以激活楊扇舟蛾幼蟲中腸細胞內的自噬反應，這與Cry 脅迫后秀麗隱桿線蟲中腸內發(fā)生的自噬反應研究結果類似，但由于楊扇舟蛾為非參考基因組物種，關于介導細胞自噬的轉錄因子還需進一步研究。