摘要 [目的]研究外源水楊酸對(duì)烏龍茶咖啡堿合成代謝的影響。[方法]以烏龍茶品種“鐵觀音”幼苗為試驗(yàn)材料，分析外源水楊酸對(duì)烏龍茶葉片咖啡堿含量、咖啡堿合成酶基因表達(dá)及其合成途徑中間代謝產(chǎn)物含量的影響。[結(jié)果]外源水楊酸提高烏龍茶葉片咖啡堿含量、激活烏龍茶咖啡堿合成酶的基因表達(dá)，增加咖啡堿可可堿、1，7-二甲基黃嘌呤和茶堿等合成途徑中間產(chǎn)物的含量，有利于咖啡堿的累積。[結(jié)論]水楊酸對(duì)咖啡堿生物合成具有濃度效應(yīng)，2.0 mmol/L 水楊酸最有利于鐵觀音咖啡堿的生物合成。

關(guān)鍵詞 鐵觀音;外源水楊酸;咖啡堿;生理特性;基因表達(dá)

中圖分類號(hào) S571.1 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2020）19-0048-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.19.014

Abstract [Objective]To study the effects of exogenous salicylic acid on the synthesis and metabolism of caffeine in Oolong tea.[Method]The seedlings of Tieguanyin，a oolong tea variety，were used to study the effects of different concentrations of salicylic acid on the gene expression of caffeine，caffeine synthetase and the content of intermediate products of caffeine synthesis pathway.[Result]Exogenous salicylic acid increased the content of caffeine in Oolong tea，activated the gene expression of caffeine synthetase，and increased the content of theobromine，1，7dimethylxanthine and theophylline，the intermediate products of caffeine synthesis pathway，so as to promote the biosynthesis of caffeine.[Conclusion]Salicylic acid has a concentration effect on caffeine metabolism，2.0 mmol/L salicylic acid is the most favorable for caffeine production.

Key words Tieguanyin;Exogenous salicylic acid;Caffeine;Physiological characteristics;Gene expression

基金項(xiàng)目 福建省產(chǎn)業(yè)技術(shù)聯(lián)合創(chuàng)新項(xiàng)目（閩發(fā)改高技〔2014〕514號(hào)）;泉州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2018N16）。

作者簡介 蔡金福（1977—），男，福建南安人，高級(jí)農(nóng)藝師，從事茶樹品種選育與高效生產(chǎn)技術(shù)研究。

收稿日期 2019-12-18;修回日期 2020-03-06

福建是全國最大的烏龍茶生產(chǎn)省份和發(fā)源地，生產(chǎn)歷史悠久，產(chǎn)品特色明顯，在國內(nèi)外市場享有較高的聲譽(yù)。福建素有“茶樹良種王國”之稱，也是國內(nèi)烏龍茶茶樹品種資源最豐富的地區(qū)[1]。茶葉品質(zhì)主要包括茶葉中的氨基酸指數(shù)以及茶多酚的含量，還包括咖啡堿以及可溶性糖的含量等?？Х葔A是茶湯中苦味的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，對(duì)茶葉品質(zhì)有非常重要的影響[2]。它具有興奮神經(jīng)中樞、提神和醒腦的功效，同時(shí)對(duì)人的呼吸和心臟系統(tǒng)也有興奮作用[3]。另外，咖啡堿在治療癌癥、阿爾茲海默病、帕金森病[4]等方面也有一定的作用。

水楊酸是小分子酚類化合物，普遍存在于植物體內(nèi)，通過調(diào)節(jié)植物的各代謝途徑，從而誘導(dǎo)植物體內(nèi)合成酚類、黃酮類等次生代謝產(chǎn)物[5-6]。外源水楊酸在植物抗性應(yīng)用方面已有相關(guān)報(bào)道[7-9]，咖啡堿代謝研究主要集中于微生物發(fā)酵、外源誘導(dǎo)物ZMZ和合成基因功能等方面[10-11]，利用外源水楊酸調(diào)節(jié)咖啡堿代謝的研究鮮見報(bào)道[12]。鑒于此，筆者對(duì) “鐵觀音”2年生盆栽苗噴施外源水楊酸進(jìn)行了研究，分析烏龍茶葉片咖啡堿含量、咖啡堿合成酶基因表達(dá)和咖啡堿合成途徑中前體物質(zhì)含量的變化，探索烏龍茶樹咖啡堿生物合成的生理特性，旨在為烏龍茶高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)栽培提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以種植于安溪縣茶葉生產(chǎn)基地內(nèi)的2年生“鐵觀音”烏龍茶幼苗為材料，鐵觀音幼苗健康且生長健壯。將鐵觀音幼苗種植于塑料盆中，每盆種植3株;培養(yǎng)1個(gè)月，待幼苗正常生長后，選取枝梢長勢(shì)相對(duì)一致的盆栽苗用于試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2019年4—5月對(duì)茶樹進(jìn)行噴施水楊酸處理，濃度分別為1.0、2.0、3.0和4.0 mmol/L，對(duì)照處理為蒸餾水，共設(shè)計(jì)5個(gè)處理，每盆為1個(gè)處理，每個(gè)處理3次重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，各處理間隔50 cm擺放。在晴朗天氣09：00前葉面噴施水楊酸，每個(gè)星期噴施1次，共處理4次;試驗(yàn)期間用塑料薄膜遮擋自然降雨，其他按茶園田間管理進(jìn)行。試驗(yàn)結(jié)束后采集成熟功能性葉片用于各項(xiàng)生理指標(biāo)測(cè)定，葉片選取位于相同方向和節(jié)位的枝條。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1 樣品的制備。各處理采集的茶葉樣品分為2份，其中1份烘干制備成干樣，另1份用新鮮樣品;樣品分別采用熱水浸提、熱水超聲波、75%乙醇浸提、75%乙醇超聲波4種方式進(jìn)行提取待測(cè)液。提取方法為：稱取樣品150 mg，置于25 mL燒瓶中，加入沸水（或75%乙醇）20 mL，在水浴中浸泡45 min（或超聲提取45 min），過濾，定容至25 mL，置于-4 ?℃冰箱中備用。

1.3.2 咖啡堿合成途徑相關(guān)物質(zhì)含量的測(cè)定。采用高效液相色譜法測(cè)定咖啡堿合成途徑中間產(chǎn)物可可堿、1，7-二甲基黃嘌呤、茶堿和咖啡堿4種物質(zhì)含量[13]。色譜柱采用InertsiL-ODC C18（250.0 mm×4.6 mm，5 μm），35 ℃柱溫;流動(dòng)相為甲醇/超純水=40/60，流速為0.4 mL/min，20 μL進(jìn)樣量;在271 nm波長下檢測(cè)。

1.3.3 咖啡堿合成酶基因表達(dá)。

RNA提取采用TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit試劑盒;以總RNA為模板合成cDNA第1鏈;以cDNA為模板應(yīng)用SYBR Premix ExTaqTMII試劑盒進(jìn)行熒光定量表達(dá)，咖啡堿合成酶基因（TCS）引物（表1）由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。

以GADPH為內(nèi)參基因，每個(gè)樣品對(duì)照基因與測(cè)定基因分別設(shè)3個(gè)重復(fù)和1個(gè)陰性對(duì)照，反應(yīng)結(jié)束后觀察溶解曲線及擴(kuò)增曲線，采用2-ΔΔCT法進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量計(jì)算。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析 采用Microsoft Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和圖表制作，采用Duncans新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 咖啡堿前體物質(zhì)含量的回歸方程 咖啡堿合成途徑中的主要物質(zhì)有1，7-二甲基黃嘌呤、可可堿、咖啡堿和茶堿。采用高效液相色譜法建立4種物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品的回歸方程，4種物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液的分離圖譜見圖1。從圖1可以看出，咖啡堿合成途徑4種物質(zhì)的保留時(shí)間不同，其出峰先后順序分別為可可堿、1，7-二甲基黃嘌呤、茶堿和咖啡堿。

以4種物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析，這4種物質(zhì)的相關(guān)系數(shù)均大于0.99，符合回歸方程要求，建立咖啡堿合成途徑中間物質(zhì)1，7-二甲基黃嘌呤、可可堿、咖啡堿和茶堿的回歸方程（表2）。

2.2 樣品提取方式對(duì)咖啡堿含量的影響

樣品制備和提取方法對(duì)茶葉咖啡堿含量有直接影響。由圖2可知，樣品烘干后咖啡堿含量顯著高于鮮樣，咖啡堿含量提高了98.4%～190.0%，其中75%乙醇超聲處理的咖啡堿含量最高，為7.549 μg/mg，這主要是由于烘干降低樣品的含水量，從而提高咖啡堿含量。

不同提取方式中，熱水結(jié)合超聲波處理的咖啡堿含量高于熱水浸提處理，乙醇結(jié)合超聲波處理的咖啡堿含量顯著高于乙醇浸提處理，這是由于超聲波處理加快樣品中細(xì)胞破裂有利于咖啡堿的提取。提取溶劑中，75%乙醇處理的咖啡堿含量顯著高于熱水處理，這是由于有機(jī)溶劑能促進(jìn)咖啡堿溶解，從而提高咖啡堿提取效果。因此， 75%乙醇結(jié)合超聲波處理樣品能準(zhǔn)確提取茶葉中咖啡堿。

2.3 水楊酸對(duì)烏龍茶咖啡堿含量的影響

烏龍茶樹噴施水楊酸能夠提高茶葉咖啡堿含量。由圖3可知，隨著水楊酸濃度的增加，茶葉咖啡堿含量出現(xiàn)先升高后下降的變化，且水楊酸處理的咖啡堿含量均顯著高于對(duì)照;2.0 mmol/L水楊酸條件下，咖啡堿含量達(dá)到最大值，比對(duì)照增加29.3%;隨后咖啡堿含量緩慢下降;4.0 mmol/L水楊酸時(shí)，咖啡堿含量降為最低值，但仍高于對(duì)照。因此，水楊酸對(duì)咖啡堿合成起到明顯的促進(jìn)作用。

2.4 水楊酸對(duì)烏龍茶咖啡堿合成酶基因表達(dá)的影響

咖啡堿合成酶（TCS）是茶樹中咖啡堿合成途徑的關(guān)鍵酶基因。由圖3可知，噴施水楊酸后，茶樹的咖啡堿合成酶基因相對(duì)表達(dá)量顯著提高;隨著水楊酸濃度的增加，TCS基因相對(duì)表達(dá)量呈先上升后下降的趨勢(shì)，2 mmol/L水楊酸條件下， TCS基因相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最大值，比對(duì)照增加2.18倍;隨后TCS基因表達(dá)量下降;4 mmol/L水楊酸條件下，TCS基因相對(duì)表達(dá)量降為最低值，但比對(duì)照增加98.06%，且顯著高于對(duì)照。

2.5 水楊酸對(duì)咖啡堿合成途徑中間物含量的影響

可可堿、1，7-二甲基黃嘌呤和茶堿是咖啡堿合成途徑中間產(chǎn)物，是咖啡堿的前體物質(zhì)，直接影響咖啡堿的生成。由圖5可知，咖啡堿合成途徑前體物質(zhì)含量的變化與咖啡堿含量變化基本一致。水楊酸處理均顯著提高可可堿、1，7-二甲基黃嘌呤和茶堿含量;隨著水楊酸濃度逐漸升高，咖啡堿合成途徑3種前體物質(zhì)呈先升高后下降的趨勢(shì);1.0 mmol/L水楊酸條件下，3種前體物質(zhì)可可堿、1，7-二甲基黃嘌呤和茶堿含量均達(dá)到最大值，分別比對(duì)照增加60.89%、53.51%和498.69%;隨后這3種前體物質(zhì)含量均逐漸降低;水楊酸濃度為4.0 mmol/L時(shí)，3種前體物質(zhì)含量降為最低值，但仍顯著高于對(duì)照。

3 結(jié)論與討論

水楊酸是植物抗逆的內(nèi)源信號(hào)物，可以激活植物的防御反應(yīng)，誘導(dǎo)植物體內(nèi)某些次生代謝產(chǎn)物的生物合成[5]。植物中高水平的水楊酸可誘導(dǎo)香豆素、類胡蘿卜素等多種羥基苯甲酸和羥基苯丙烯酸衍生物的合成[14]。水楊酸處理丹參細(xì)胞可增加丹參細(xì)胞里酚類物質(zhì)，也可提高超氧化物歧化酶、過氧化物酶和羥基苯丙酮酸雙氧化酶等酶的活性[15]。添加低濃度水楊酸提高人參皂苷和糖苷的合成量[16-17]。在黃芩愈傷組織繼代培養(yǎng)中添加50 μmol/L水楊酸時(shí)，黃芩苷含量提高1.63 倍[18]。該研究中噴施2.0 mmol/L水楊酸可顯著促進(jìn)茶樹咖啡堿含量的增加，而較高濃度的水楊酸對(duì)咖啡堿的生成不明顯，這與前人的研究報(bào)道基本一致。因此，葉面噴施適宜濃度的外源水楊酸（2.0 mmol/L）可以提高茶樹咖啡堿含量，有效促進(jìn)咖啡堿積累。

水楊酸還可以誘導(dǎo)植物體內(nèi)某些次生代謝產(chǎn)物的生物合成[19]。咖啡堿作為茶樹中重要的次生代謝產(chǎn)物，其體內(nèi)合成也受到咖啡堿合成代謝途徑基因表達(dá)的調(diào)控[12，20]。Maluf 等[21]發(fā)現(xiàn)高咖啡堿含量的果實(shí)中咖啡堿合成酶表達(dá)量較高，低咖啡堿含量的果實(shí)中咖啡堿合成酶表達(dá)量較低。李金等[22]比較茶樹咖啡堿合成途徑中TCS1、TIDH、SAMS的基因表達(dá)量差異與咖啡堿含量的相關(guān)性后，發(fā)現(xiàn)TCS1對(duì)茶樹咖啡堿的合成起到重要作用。鄧威威等[23]克隆出茶樹咖啡堿合成酶基因，構(gòu)建了TCS1原核表達(dá)質(zhì)粒，同時(shí)成功制備了抗TCS1的多克隆抗體。該研究中咖啡堿合成酶（TCS1）對(duì)咖啡堿合成代謝起到主要作用，2.0 mmol/L水楊酸有利于提高咖啡堿合成途徑酶基因的表達(dá)。目前，雖然克隆了部分參與咖啡堿合成代謝的關(guān)鍵酶基因，但是咖啡堿代謝途徑的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)還不清楚;水楊酸等外源物對(duì)鐵觀音咖啡堿代謝調(diào)控機(jī)理仍有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1] 劉建福，王文建，黃昆.中國烏龍茶種質(zhì)資源圖鑒[M].廈門：廈門大學(xué)出版社，2018.

[2] 付蕾，陳立貴，袁新強(qiáng)，等.從茶葉中提取咖啡堿的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（9）：3730-3731.

[3] HILDEBRAND J S，PATEL A V，MCCULLOUGH M L，et al.Coffee，tea，and fatal oral/ pharyngeal cancer in a large prospective US cohort [J].American journal of epidemiology，2012，177（1）：50-58.

[4] MAIA L，DE MENDONCA A.Does caffeine intake protect from Alzheimers disease？[J].Eur J Neurol，2002，9（4）：377-382.

[5] 李鉑，唐志書，王楠，等.葉面噴施水楊酸對(duì)當(dāng)歸幼苗生理特性和保護(hù)酶活性的影響[J].中國現(xiàn)代中藥，2019，21（5）：634-637.

[6] 孟雪嬌，邸昆，丁國華.水楊酸在植物體內(nèi)的生理作用研究進(jìn)展[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010，26（15）：207-214.

[7] 巴青松，宋瑜龍，張?zhí)m蘭，等.根施水楊酸對(duì)鉛脅迫下小麥根系生長發(fā)育的影響[J].干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究，2019，37（1）：208-213.

[8] 王立紅，李星星，孫影影，等.外源水楊酸對(duì)NaCl脅迫下棉花幼苗生長生理特性的影響[J].西北植物學(xué)報(bào)，2017，37（1）：154-162.

[9] 孫玉珺，秦東玲，伊凡，等.外源水楊酸對(duì)低溫脅迫下玉米幼苗生長及生理特性的影響[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2018，34（4）：726-734.

[10] 馬存強(qiáng)，李靜，周斌星，等.黑曲霉發(fā)酵對(duì)咖啡堿代謝的影響[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2014，26（5）：42-46.

[11] 張明澤，林金科，吳亮宇，等.外源誘導(dǎo)物ZMZ對(duì)茶樹新梢咖啡堿及其他生化成分含量的影響[J].福建茶葉，2013（1）：25-26.

[12] 田奧磊.武夷巖茶大紅袍茶氨酸和咖啡堿代謝生理特性研究[D].廈門：華僑大學(xué)，2018.

[13] 王嘉琦，賈麗，夏敏.液相色譜法測(cè)定飲料中咖啡因、可可堿和茶堿[J].現(xiàn)代食品科技，2011，27（1）：114-116.

[14] SHARMA M，SHARMA A，KUMAR A，et al.Enhancement of secondary metabolites in cultured plant cells through stress stimulus [J].Am J Plant Physiol，2011，6（2）：50-71.

[15] 王春麗，梁宗鎖，李殿榮，等.茉莉酸甲酯和水楊酸對(duì)丹參幼苗中蔗糖代謝和酚酸類物質(zhì)積累的影響[J].西北植物學(xué)報(bào)，2011，31（7）：1405-1410.

[16] 陳競天，易斌，陳艾萌，等.苗期噴施水楊酸對(duì)甜葉菊主要農(nóng)藝性狀和糖苷含量的影響[J].西北植物學(xué)報(bào)，2019，39（1）：149-155.

[17] 張悅，王義，蔣世翠，等.水楊酸誘導(dǎo)下人參培養(yǎng)物差異表達(dá)基因片段的克隆[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2009，28（2）：245-250.

[18] 孟書亦，馬秀杰，韓梅，等.水楊酸對(duì)黃芩愈傷組織抗氧化酶活性及黃芩苷含量的影響[J].分子植物育種，2017，15（10）：4179-4183.

[19] LIU Y H，LIANG Z S，ZHANG Y J.Induction and in vitro alkaloid yield of calluses and protocormlike bodies （PLBs） from Pinellia ternate[J].In Vitro Cell Dev Biol Plant，2010，46（3）：239-245.

[20] 李梅，徐丹旎，李麗江，等.咖啡樹咖啡堿合成相關(guān)基因研究進(jìn)展[J].熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，38（9）：45-48.

[21] MALUF M P，DA SILVA C C，DE OLIVEIRA M DE P A，et al.Altered expression of the caffeine synthase gene in a naturally caffeinefree mutant of Coffea arabica[J].Genetics and molecular biology，2009，32（4）：802-810.

[22] 李金，魏艷麗，龐磊，等.茶樹咖啡堿合成途徑中TCS1、TIDH、SAMS 的基因表達(dá)量差異及其與咖啡堿含量的相關(guān)性[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（10）：21-24.

[23] 鄧威威，金陽，李旻，等.茶樹咖啡堿合成酶基因原核表達(dá)、及其抗體制備與鑒定[J].植物研究，2015，35（3）：333-339.