樊 琳,產(chǎn)江為,周 波,胡思海,張江華,吳耀國(guó)*

1.西北工業(yè)大學(xué)應(yīng)用化學(xué)系,陜西 西安 710129

2.中國(guó)地質(zhì)調(diào)查局西安地質(zhì)調(diào)查中心,陜西 西安 710054

氮元素是影響甚至是控制水體富營(yíng)養(yǎng)化的關(guān)鍵要素之一[1]。因此，陸地水生生態(tài)系統(tǒng)中的脫氮研究一直是我國(guó)乃至世界生物地球化學(xué)科學(xué)的學(xué)科前沿，研究解決自然界中污染水體的氮轉(zhuǎn)化規(guī)律及氮的復(fù)合污染問(wèn)題是一項(xiàng)緊迫的任務(wù)[2,3]。傳統(tǒng)的生物脫氮技術(shù)依賴(lài)于硝化作用和反硝化作用的有機(jī)結(jié)合，但由于硝化和反硝化作用的功能微生物其生態(tài)位差別非常大，硝化和反硝化作用通常需要在兩個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)器中進(jìn)行[2,4,5]。而好氧反硝化微生物的發(fā)現(xiàn)，使得硝化和反硝化作用能夠同步進(jìn)行成為可能，這不僅大大節(jié)省了基建投資費(fèi)用，反硝化過(guò)程產(chǎn)生的堿度也能夠補(bǔ)償硝化作用所消耗的酸度，進(jìn)一步減少了運(yùn)行成本[2,3]。憑借其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，好氧反硝化生物脫氮技術(shù)自提出以來(lái)，受到國(guó)內(nèi)外環(huán)境領(lǐng)域?qū)W者的廣泛關(guān)注[2-6]。因此，有必要在異養(yǎng)硝化-好氧反硝化（HN-AD）體系中研究氮的轉(zhuǎn)化規(guī)律。

目前關(guān)于HN-AD 體系中氮轉(zhuǎn)化領(lǐng)域的研究非常多[2,3,7,8]，主要集中在探究環(huán)境因子對(duì)與氮轉(zhuǎn)化的影響，例如：溫度、碳種類(lèi)、pH、C/N 和溶解氧等。例如，Zheng JH,et al.研究了低溫狀態(tài)下，異養(yǎng)硝化需氧反硝化細(xì)菌Acinetobacter harbinensisHITLi7T的脫氮能力和生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)特性[3]。Chen 等探究了DO（溶解氧）、pH、C/N（碳氮比）對(duì)異養(yǎng)硝化和好氧反硝化細(xì)菌Acinetobactersp.T1 脫氮功能的影響[5]。Fu 等研究了復(fù)合發(fā)酵液對(duì)異養(yǎng)硝化好氧反硝化細(xì)菌群落對(duì)人工濕地鹽分污水中氮去除的影響[6]。以上研究豐富了人們對(duì)影響異養(yǎng)硝化好氧反硝化菌脫氮性能的認(rèn)識(shí)，然而在自然環(huán)境中，除了以上環(huán)境因子，環(huán)境中初始氮源種類(lèi)、濃度、不同氮組成的比例等因素對(duì)HN-AD 體系中氮轉(zhuǎn)化過(guò)程也存在很大影響。而這種地域特性對(duì)于水體中氮轉(zhuǎn)化的影響研究鮮有報(bào)道。

鑒于上述，本研究將這種新型生物脫氮技術(shù)應(yīng)用到較為現(xiàn)實(shí)的自然污染水體中，通過(guò)建立HN-AD 體系模擬自然水生生態(tài)系統(tǒng)，考察了不同初始濃度、不同氮源種類(lèi)、不同氮組成對(duì)HN-AD體系中氮轉(zhuǎn)化的影響，初步探討其氮轉(zhuǎn)化機(jī)制，以期為富營(yíng)養(yǎng)化水體的修復(fù)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

NH4Cl、KI、KNaC4H12O10·4H2O，均為分析純，購(gòu)買(mǎi)自廣東光華科技股份有限公司、KNO3、NaNO2、HgI2、C12H14N2·2HCl、NH2SO3H，均為分析純，購(gòu)買(mǎi)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。本實(shí)驗(yàn)所用-N、-N 和-N 分別用NH4Cl，KNO3和NaNO2配制。其中，NH4Cl、KNO3和NaNO2標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液濃度均為100 mg/L，4 ℃冰箱下保存，實(shí)驗(yàn)中根據(jù)需要稀釋至使用濃度。實(shí)驗(yàn)用水均為超純水，電阻率不低于18 K?·cm；電子天平（上海越平）；紫外分光光度計(jì)（上海光譜）；可見(jiàn)分光光度計(jì)（尤尼珂上海）；便攜式pH 測(cè)量?jī)x、便攜式ORP 測(cè)量?jī)x（上海三信）；離心分離機(jī)（安徽中科中佳）；超聲波清洗機(jī)（昆山超聲儀器）；曝氣泵（廣東中山藍(lán)海電器）。

1.2 采樣

沉積樣和水樣采自西北工業(yè)大學(xué)長(zhǎng)安校區(qū)啟翔湖(北緯34°1′30′′-34°1′40′′，東經(jīng)108°45′3′′-108°45′40′′)，湖表面積為0.03 km2，平均水深1.4 m，最大水深3 m。該地區(qū)屬典型的大陸性季風(fēng)氣候，夏季炎熱多雨，冬季寒冷干燥，年均氣溫15.6 ℃，年平均降水量約554 mm(夏秋季多雨)。在20 個(gè)隨機(jī)沿湖堤岸的沉積-水界面分別采集沉積物樣和水樣，其中采集的20 個(gè)沉積樣混合均勻后形成復(fù)合樣品，20 個(gè)水樣等比例混合均勻形成水樣。水樣和沉積物樣品的理化性質(zhì)見(jiàn)表1 所示。

表1 水和沉積物樣品的物理化學(xué)性質(zhì)(n=3)Table 1 Physicochemical property of the water and sediment samples(n=3)

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

將100 g 均質(zhì)沉積物和800 mL 湖水注入1000 mL 棕色玻璃瓶中，同時(shí)根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐饧舆m宜的化學(xué)組分。微宇宙實(shí)驗(yàn)是在持續(xù)曝氣反應(yīng)器中進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)裝置如圖1 所示。每個(gè)反應(yīng)器中根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求，加入不同濃度的-N、-N、-N 等化學(xué)物質(zhì)構(gòu)成微宇宙系統(tǒng)。

分別取5 mL待測(cè)溶液于離心管中，于10000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min取上清液測(cè)量溶液中-N、-N、-N 含量。其中，-N 測(cè)定采用納氏試劑法、-N 測(cè)定采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法、-N 測(cè)定采用紫外分光光度法。

2 結(jié)果與討論

本實(shí)驗(yàn)設(shè)置6×3 組實(shí)驗(yàn)，其中D1、D2、E1、E2、F1、F26 組實(shí)驗(yàn)分別為-N 與-N 組合、-N 與-N 組合、-N 與-N 組合等多種組合形式中的一種。試驗(yàn)中通過(guò)對(duì)比單一氮源條件下體系中氮轉(zhuǎn)化的規(guī)律，得出一種氮源的介入對(duì)另一種固定氮源氮轉(zhuǎn)化帶來(lái)的影響。其中，D1與D2組分別探究-N 與-N 的介入對(duì)-N 轉(zhuǎn)化的影響，E1與E2組分別探究-N 與-N 的介入對(duì)-N 轉(zhuǎn)化的影響，F(xiàn)1與F2組分別探究-N 與-N 的介入對(duì)-N 轉(zhuǎn)化的影響。每組實(shí)驗(yàn)下又設(shè)置3 小組，分別探究0，25，50 mg/L 3 種濃度的介入氮源對(duì)已有氮源的影響情況。所有實(shí)驗(yàn)小組均于上述已經(jīng)確定的體系中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)探究，各小組均添加曝氣裝置，不添加外來(lái)碳源。不加碳的原因是：（1）搭建體系中的沉積物含有碳源；（2）確立體系實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，外加碳后，體系內(nèi)氮轉(zhuǎn)化速率過(guò)快，不利于研究進(jìn)行。

設(shè)置D1-1、D1-2、D1-3、D2-1、D2-2、D2-36 小組實(shí)驗(yàn)。其中D1組中3 個(gè)實(shí)驗(yàn)分別探究0，25，50 mg/L濃度的-N 對(duì)50 mg/L-N 中氮轉(zhuǎn)化過(guò)程的影響；D2組中3 個(gè)實(shí)驗(yàn)分別探究0，25，50 mg/L濃度的-N 對(duì)50 mg/L-N 中氮轉(zhuǎn)化過(guò)程的影響。圖2 是硝態(tài)氮加入對(duì)氨氮體系中氮轉(zhuǎn)化的影響情況。圖3 是亞硝態(tài)氮加入對(duì)氨氮體系中氮轉(zhuǎn)化的影響。該實(shí)驗(yàn)過(guò)程中持續(xù)監(jiān)測(cè)DO 含量，數(shù)據(jù)顯示DO 始終維持在7～9 mg/L 范圍內(nèi)，整個(gè)反應(yīng)過(guò)程均于好氧條件下進(jìn)行。

圖2 硝態(tài)氮加入對(duì)氨氮體系中氮轉(zhuǎn)化的影響Fig.2 Effect of NO3--N on the nitrogen transformation in -N system

由圖2 可以看出，濃度相同的氨氮體系中投加不同濃度的硝態(tài)氮后，氮轉(zhuǎn)化特點(diǎn)為：（1）對(duì)比D1-1未投加硝態(tài)氮組別，其他兩組加入硝態(tài)氮的組別中，前5 d 內(nèi)氨氮降解速率明顯加快，且比較D1-2和D1-3隨著硝態(tài)氮濃度增加，氨氮的去除率越大；（2）加入硝態(tài)氮后，體系中亞硝態(tài)氮的最大積累濃度沒(méi)有明顯變化，但達(dá)到該值的時(shí)間明顯前移；（3）整個(gè)反應(yīng)體系中硝態(tài)氮濃度反應(yīng)前后幾乎沒(méi)有變化。這是由于加入硝態(tài)氮導(dǎo)致氨氮降解速率增大，是因?yàn)橄鯌B(tài)氮有利于增加羥胺氧化酶的活性，進(jìn)而加速氨氮向亞硝態(tài)氮的轉(zhuǎn)化[7,9]。這也是導(dǎo)致亞硝態(tài)氮峰值前移的原因之一，另外隨著硝態(tài)氮的量增加，反硝化作用中反應(yīng)物濃度增大，又有利于反硝化→進(jìn)行，這也導(dǎo)致了前期亞硝態(tài)氮的積累速度增加。整個(gè)反應(yīng)過(guò)程中，硝態(tài)氮濃度存在起伏波動(dòng)，但最終在反應(yīng)前后其含量維持不變，這可能是由于硝化作用和反硝化作用產(chǎn)生和消耗的硝態(tài)氮量幾乎抵消[10,11]。

由圖3 可以看出，濃度相同的氨氮體系中投加不同濃度的亞硝態(tài)氮后，氮轉(zhuǎn)化特點(diǎn)為：（1）對(duì)比D2-1未投加亞硝態(tài)氮組別，其他兩組加入亞硝態(tài)氮的組別中，氨氮的去除率增加；比較D2-2和D2-3隨著亞硝態(tài)氮濃度增加，氨氮去除率沒(méi)有明顯變化，甚至有下降趨勢(shì)。（2）體系中亞硝態(tài)氮含量一直處于遞減，起始亞硝態(tài)氮濃度為25 mg/L 時(shí)，亞硝態(tài)氮大約在第20 d 降解完全，去除速率為1.19 mg/L/d，起始亞硝態(tài)氮濃度增加到50 mg/L 時(shí)，反應(yīng)到30 d 時(shí)，去除速率為1.26 mg/L/d，因此增加亞硝態(tài)含量對(duì)其自身的去除影響不大。（3）由于亞硝態(tài)氮介入，硝態(tài)氮積累濃度出現(xiàn)大幅增長(zhǎng)。但起始亞硝態(tài)氮濃度為50 mg/L 的體系中硝態(tài)氮的積累量反而小于25 mg/L 的體系。這說(shuō)明亞硝態(tài)氮的介入有利于反硝化細(xì)菌的生長(zhǎng)[8,11,12]，進(jìn)而促進(jìn)亞硝態(tài)氮向氮?dú)獾霓D(zhuǎn)化反應(yīng)→N2O ↑→(N2)↑。從而使得→轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物減少，進(jìn)而促進(jìn)硝化作用進(jìn)行，增加氨氮的去除率。

體系中增加亞硝態(tài)氮，對(duì)其去除速率影響較小的原因有兩個(gè)方面：一方面可能是體系已經(jīng)達(dá)到了對(duì)亞硝態(tài)氮去除的最大負(fù)荷；另一方面較高濃度的亞硝態(tài)氮具有一定的毒性，會(huì)抑制微生物的活性，進(jìn)而減慢了其去除速率[7,11-13]。隨著亞硝態(tài)氮的介入，硝態(tài)氮的大量積累的原因有：一方面亞硝態(tài)氮是硝化作用→的反應(yīng)物，增大反應(yīng)物濃度有利于促進(jìn)反應(yīng)進(jìn)行，故增加了硝態(tài)氮積累；另一方面亞硝態(tài)氮也是反硝化過(guò)程→的產(chǎn)物，增大產(chǎn)物濃度會(huì)抑制反應(yīng)進(jìn)行，進(jìn)一步促進(jìn)了硝態(tài)氮的積累[9,11,14,15]。增加亞硝態(tài)氮含量會(huì)降低生物活性，因此過(guò)多的亞硝態(tài)氮可能不利于硝化作用積累更多的硝態(tài)氮。

圖4 氨氮加入對(duì)硝態(tài)氮體系中氮轉(zhuǎn)化的影響Fig.4 Effect of -N on the nitrogen transformation in NO3--N system

圖4 所示，向濃度相同的硝態(tài)氮體系中投加濃度不同的氨氮后，體系中氮轉(zhuǎn)化的特點(diǎn)為：（1）對(duì)比E1-1未投加氨氮組別，其他兩組加入氨氮，硝態(tài)氮的轉(zhuǎn)化作用出現(xiàn)了明顯抑制；比較E1-2和E1-3可知，氨氮濃度增加對(duì)硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化影響作用的提高不明顯。（2）氨氮本身的變化情況隨著濃度升高。（3）隨著氨氮濃度的增加，體系中亞硝態(tài)氮的積累量降低，且達(dá)到最大值時(shí)間前移。

加入氨氮對(duì)硝態(tài)氮的降解有抑制作用，有幾方面因素：（1）氨氮可以直接作為細(xì)菌合成生物大分子例如蛋白質(zhì)的氮源，一般認(rèn)為氨氮作為氮源要優(yōu)于硝態(tài)氮[9,14,15]。因此，向硝態(tài)氮體系中加入氨氮會(huì)影響微生物對(duì)硝態(tài)氮的降解。（2）加入氨氮后，體系中微生物優(yōu)先利用氨氮進(jìn)行硝化作用會(huì)產(chǎn)生硝態(tài)氮，這也彌補(bǔ)了反硝化消耗的硝態(tài)氮[7,13]。因此導(dǎo)致反應(yīng)前后檢測(cè)到的硝態(tài)氮濃度幾乎保持不變，甚至出現(xiàn)積累。整個(gè)反應(yīng)過(guò)程，反應(yīng)前后亞硝態(tài)氮的積累量減小，主要是因?yàn)轶w系中反硝化作用由于氨氮的介入受抑制：→。而加入氨氮體系中，前期亞硝態(tài)氮的積累主要是由于硝化作用產(chǎn)生→，加入的氨氮濃度越高，亞硝態(tài)氮的積累量越大且達(dá)到最大值的時(shí)間越早。

圖5 亞硝態(tài)氮加入對(duì)硝態(tài)氮體系中氮轉(zhuǎn)化的影響Fig.5 Effect of -N on the nitrogen transformation in NO3—N system

圖5 可以看出，向濃度相同的硝態(tài)氮體系中投加濃度不同的亞硝態(tài)氮后，氮轉(zhuǎn)化特點(diǎn)為：（1）對(duì)比E2-1未投加亞硝態(tài)氮組別，其他兩組加入亞硝態(tài)氮的組別中，硝態(tài)氮的轉(zhuǎn)化受到了極大地抑制作用，未加入亞硝態(tài)氮時(shí)，其轉(zhuǎn)化率達(dá)到了50%，但加入了亞硝酸鹽后，體系中硝態(tài)氮幾乎沒(méi)有降解，甚至產(chǎn)生了少量積累；比較E2-2和E2-3可知，改變投加亞硝態(tài)氮的濃度對(duì)硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化影響作用不明顯。（2）亞硝態(tài)氮的加入對(duì)于氨氮的積累也有一定的抑制，這與D2組別中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，增加體系中亞硝態(tài)氮濃度有利于氨氮降解，故不利于其積累；（3）在硝態(tài)氮體系中投加亞硝態(tài)氮，亞硝態(tài)氮本身的降解并未受到影響。

圖6 可以看出，向濃度相同的亞硝態(tài)氮體系中投加濃度不同的氨氮后，體系中氮轉(zhuǎn)化的特點(diǎn)為：（1）對(duì)比F1-1（未投加氨氮）和F1-2，F(xiàn)1-3（投加氨氮），前6 d 體系中主要發(fā)生硝化作用，體系中氨氮濃度下降，亞硝態(tài)氮濃度維持穩(wěn)定，尤其是→轉(zhuǎn)化過(guò)程明顯加快，體系中硝態(tài)氮的積累增大。特別是前3 d 體系中溶解性無(wú)機(jī)氮濃度相對(duì)穩(wěn)定，說(shuō)明此時(shí)體系中正在進(jìn)行：→→的反應(yīng)，在此過(guò)程中，亞硝態(tài)氮的濃度并未出現(xiàn)下降現(xiàn)象。反應(yīng)第3 d 到第5 d 體系中氨氮濃度不再下降，亞硝態(tài)氮濃度開(kāi)始下降，硝態(tài)氮濃度達(dá)到峰值，體系內(nèi)溶解性無(wú)機(jī)氮略有下降，說(shuō)明此時(shí)體系中存在→的硝化反應(yīng)和→N2的反硝化反應(yīng)。（2）反應(yīng)進(jìn)行6 d 后，體系中亞硝態(tài)氮濃度繼續(xù)下降，而氨氮與硝態(tài)氮濃度幾乎維持穩(wěn)定，整體溶解性無(wú)機(jī)氮濃度也在下降。最后到達(dá)第20 d 時(shí)，體系中伴隨亞硝態(tài)氮濃度持續(xù)降低，硝態(tài)氮濃度也開(kāi)始下降，體系中主要進(jìn)行反硝化反應(yīng)。

圖6 氨氮加入對(duì)亞硝態(tài)氮體系中氮轉(zhuǎn)化的影響Fig.6 Effect of -N on the nitrogen transformation in -N system

圖7 硝態(tài)氮加入對(duì)亞硝態(tài)氮體系中氮轉(zhuǎn)化的影響Fig.7 Effect of -N on the nitrogen transformation in -N system

由圖7 可知，向濃度相同的亞硝態(tài)氮體系中投加濃度不同的硝態(tài)氮，氮轉(zhuǎn)化的特點(diǎn)為：（1）對(duì)比F2-1（未投加硝態(tài)氮）和F2-2，F(xiàn)2-3（投加硝態(tài)氮），亞硝態(tài)氮降解速率下降。加入硝態(tài)氮濃度越大，對(duì)亞硝態(tài)氮的降解率越小。（2）硝態(tài)氮的加入，氨氮的積累量減少。（3）隨著硝態(tài)氮加入，體系內(nèi)硝態(tài)氮積累含量反而增加，這導(dǎo)致體系內(nèi)DIN 去除率大大降低，且硝態(tài)氮濃度越大，抑制DIN 去除作用越明顯。加入-N 對(duì)-N 體系中氮轉(zhuǎn)化影響，有以下幾方面因素：（1）體系中亞硝態(tài)氮降解減慢，是因?yàn)橄鯌B(tài)氮是硝化反應(yīng)的產(chǎn)物：→，加入產(chǎn)物會(huì)影響反應(yīng)進(jìn)度；硝態(tài)氮是反硝化的反應(yīng)物：→，反應(yīng)有利于的積累。對(duì)比F2-1和F2-2，F(xiàn)2-3，硝態(tài)氮的加入會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致亞硝態(tài)氮的累積，會(huì)降低亞硝態(tài)氮的降解率[11,15,17]。（2）加入硝態(tài)氮導(dǎo)致氨氮積累量減小，一方面是因?yàn)橄鯌B(tài)氮有利于增加羥胺氧化酶的活性，進(jìn)而加速氨氮向亞硝態(tài)氮的轉(zhuǎn)化，減小其積累量，這與D1的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象一致。另一方面，硝態(tài)氮加入，不利于體系中亞硝態(tài)氮的同化反應(yīng)進(jìn)行：。（3）當(dāng)體系中含有亞硝態(tài)氮時(shí)，體系中硝態(tài)氮的含量幾乎維持不變，但增加硝態(tài)氮不影響亞硝態(tài)氮最終的去除率，故導(dǎo)致體系中DIN 的去除率大大減小。

3 結(jié)論

通過(guò)模擬自然水生生態(tài)系統(tǒng)，構(gòu)建HN-AD 體系，探究在該體系下氮組成對(duì)氮轉(zhuǎn)化的影響。HN-AD 體系中以-N/-N、-N/-N、-N/-N 等不同組合氮源作為體系中外來(lái)碳源，一種氮源對(duì)另一種氮源氮轉(zhuǎn)化影響為：（1）當(dāng)-N 與-N 分別加入到含有-N 的體系中，加速體系中氨氮的降解，氨氮的降解率從30%分別提高到65%和55%；（2）當(dāng)-N 與-N 分別加入到含有-N 的體系中，會(huì)嚴(yán)重影響硝態(tài)氮的降解，-N 的體系中硝態(tài)氮的降解率從50%左右下降到幾乎不降解，-N 的體系中硝態(tài)氮濃度甚至?xí)黾?；?）當(dāng)-N 與-N 加入到含有-N 的體系中，會(huì)降低亞硝態(tài)氮的降解率，但亞硝態(tài)氮的轉(zhuǎn)化率幾乎都能達(dá)到100%。因此，在水生生態(tài)系統(tǒng)中存在HN-AD 體系并導(dǎo)致氮轉(zhuǎn)化率的提高，而培養(yǎng)良好的HN-AD沉積物可能是修復(fù)富營(yíng)養(yǎng)化水體的有用生物工具，研究結(jié)果為修復(fù)水體氮污染水體提供理論依據(jù)。