李向勇，李春輝，粟玉剛，范 鐵，隆雪明

（1.長(zhǎng)沙生態(tài)動(dòng)物園，湖南長(zhǎng)沙 410118；2.長(zhǎng)沙市農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法局，湖南長(zhǎng)沙 410013；3.湖南省獸藥飼料監(jiān)察所，湖南長(zhǎng)沙 410006）

毛首線蟲(chóng)（或毛尾線蟲(chóng)）也稱(chēng)為鞭蟲(chóng)（whipworm），屬于毛尾目（Trichurata）、毛尾科（Trichuridae）、毛尾屬（Trichuris），成蟲(chóng)寄生于人與動(dòng)物的盲腸[1-2]。毛首線蟲(chóng)?。╰richuriasis）是人與動(dòng)物常見(jiàn)的寄生蟲(chóng)病，呈世界性分布，多分布于熱帶地區(qū)（包括中國(guó)），是一種容易被忽視的熱帶寄生蟲(chóng)病[3]。據(jù)報(bào)道[4-5]，全球毛首線蟲(chóng)感染人數(shù)為（6.04～7.95）億。金絲猴（Rhinopithecus roxellana）是我國(guó)特有的動(dòng)物，被我國(guó)政府和《瀕危野生動(dòng)植物種國(guó)際貿(mào)易公約》（CITES）列為一級(jí)保護(hù)物種[6]，被列入國(guó)際自然保護(hù)聯(lián)盟（IUCN）瀕危物種紅色名錄中的瀕危物種?，F(xiàn)如今，金絲猴種群繁衍除了面臨棲息地被侵犯外，還有來(lái)自病毒和毛首線蟲(chóng)的感染困擾[7]。因此，正確鑒定毛首線蟲(chóng)種類(lèi)，不僅具有重要學(xué)術(shù)價(jià)值，而且對(duì)預(yù)防和控制毛首線蟲(chóng)病也具有重要的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)意義。

毛首線蟲(chóng)的種內(nèi)鑒定一直是國(guó)際性難題。毛首線蟲(chóng)具有特殊的外形，雖然很容易鑒定到屬，但是種內(nèi)鑒定只能靠蟲(chóng)體大小、交合刺長(zhǎng)度、交合刺鞘以及蟲(chóng)卵等形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行鑒定[8]。當(dāng)遇到形態(tài)相似性較高的蟲(chóng)體和蟲(chóng)卵時(shí)，傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定具有很大的局限性。如今，選用合適的基因分子標(biāo)記，是寄生蟲(chóng)分子分類(lèi)學(xué)的首要任務(wù)。線粒體DNA（mtDNA）具有進(jìn)化速度快、基因突變率高、母性遺傳等特點(diǎn)，是研究寄生蟲(chóng)系統(tǒng)發(fā)生學(xué)、群體遺傳學(xué)和分子分類(lèi)的理想分子標(biāo)記[9-11]。而線粒體細(xì)胞色素c 氧化酶Ⅰ亞基（cox1）基因作為編碼基因，進(jìn)化速度快，以母系遺傳為主，且不受基因重組、易位等激變影響，被國(guó)際DNA 條形碼聯(lián)盟推薦為首選基因[12]。本研究以采自長(zhǎng)沙生態(tài)動(dòng)物園金絲猴體內(nèi)的毛首線蟲(chóng)作為研究對(duì)象，通過(guò)PCR 擴(kuò)增其部分cox1基因（pcox1）序列并進(jìn)行分析，從而明確金絲猴毛首線蟲(chóng)線粒體cox1基因部分序列能否成為理想的種間遺傳標(biāo)記，旨在為今后金絲猴毛首線蟲(chóng)的分類(lèi)、鑒別及本病的防治等奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 蟲(chóng)體樣品

本試驗(yàn)研究的6 條金絲猴毛首線蟲(chóng)樣品于2017 年采自長(zhǎng)沙生態(tài)動(dòng)物園（金絲猴2016 年從上海野生動(dòng)物園引進(jìn)），樣品代碼標(biāo)記為B-1、B-2、B-3、B-4、B-5、B-6。

1.2 主要試劑

蛋白酶K，購(gòu)自Merck 公司；WizardTMDNA Clean-up System 試劑盒，購(gòu) 自Promega 公 司；EmeraldAmp Max HS PCR Master Mix、DL 2 000 DNA Marker，均購(gòu)自TaKaRa 公司。

1.3 樣品DNA 制備

先利用解剖顯微鏡觀察蟲(chóng)體樣品的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)，并用高清照相機(jī)拍下蟲(chóng)體圖片進(jìn)行初步形態(tài)學(xué)鑒定。樣品保存于裝有70%酒精的玻璃瓶中，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

從70%的酒精保存液中取出單個(gè)蟲(chóng)體，用雙蒸水反復(fù)吹打沖洗3 次后，置于新的1.5 mL Eppendorf 管中；用滅菌的微型剪刀將蟲(chóng)體組織剪碎，并反復(fù)研磨，然后根據(jù)WizardTMDNA Cleanup System 試劑盒說(shuō)明書(shū)添加消化體系與20 μL 蛋白酶K；混勻后，放于55 ℃恒溫水浴箱中消化15～18 h；將消化好的混懸液再根據(jù)說(shuō)明書(shū)提取蟲(chóng)體DNA，DNA 樣品分裝后置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR 擴(kuò)增pcox1 基因

根據(jù)Bowles等[13]報(bào)道的引物JB3 和JB4.5（JB3：5'-TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT-3'，24 bp；JB4.5：5'-TAAAGAAAGAACATAATGAAAATG-3'，24 bp）來(lái)擴(kuò)增線粒體pcox1，隨后將引物交予生工生物工程（上海）股份有限公司合成。擴(kuò)增體系為25μL：上下游引物各0.5 μL，模板DNA 1 μL，雙蒸水10.5 μL，EmeraldAmp Max HS PCR Master Mix 12.5 μL。PCR 過(guò)程：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共36 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。取5 μL PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1%TAE 瓊脂糖凝膠電泳，用Good View Nucleic Acid Stain 染色，紫外投射儀下觀察結(jié)果，凝膠成像系統(tǒng)攝像。

1.5 pcox1 基因序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

將PCR 產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用DNAstar 5.0 軟件分析，從GenBank 檢索現(xiàn)有毛尾科毛首線蟲(chóng)屬毛首線蟲(chóng)的cox1基因序列（表1），然后與之進(jìn)行相似性比對(duì)并構(gòu)建毛首線蟲(chóng)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，以旋毛蟲(chóng)（Trichinella spiralis，KU321696.1）作為外群，利用ClustalX 1.81 及Mega 5.0 軟件對(duì)獲得的序列和GenBank 的毛首線蟲(chóng)pcox1部分序列進(jìn)行比對(duì)及遺傳距離計(jì)算，同時(shí)利用Mega5.0 程序中的鄰位相連法（Neighbor-Joining，NJ）反復(fù)運(yùn)算1 000 次，選取最佳模型，繪制種系發(fā)育樹(shù)。

表1 代表性的毛首線蟲(chóng)cox1 序列信息

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)檢查

顯微鏡下觀察到雄蟲(chóng)交合刺（圖1）和蟲(chóng)卵（圖2），經(jīng)反復(fù)對(duì)照文獻(xiàn)和寄生蟲(chóng)圖譜結(jié)合蟲(chóng)體照片（圖3～4），初步確定為金絲猴毛首線蟲(chóng)（Trichuris rhinopiptheroxella）。

圖1 雄蟲(chóng)交合刺

圖2 蟲(chóng)卵

2.2 PCR 擴(kuò)增

經(jīng)PCR 擴(kuò)增，6 個(gè)樣品均成功擴(kuò)增出長(zhǎng)度為411 bp 的基因片段，與預(yù)期pcox1基因目的片段長(zhǎng)度相符，且無(wú)非特異性條帶，空白對(duì)照為陰性（圖5）。

圖3 雌蟲(chóng)局部

圖4 蟲(chóng)體

圖5 毛首線蟲(chóng)線粒體pcox1 基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果

2.3 測(cè)序及分析

擴(kuò)增所獲得的pcox1序列減除引物后長(zhǎng)度一致，均為411 bp。將所測(cè)得的6 個(gè)樣本個(gè)體的pcox1序列進(jìn)行種內(nèi)比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些樣本的pcox1序列完全一致，無(wú)種內(nèi)變異。序列中A、G、T、C 含量分別為26.52%、18.73%、36.74%、18.00%。其中A+T 含量（63.26%）明顯高于C+G含量（36.74%）。pcox1基因序列種間分析結(jié)果顯示，種間差異較大，差異率為24.0%～34.1%。

2.4 cox1 基因序列系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)

采用NJ 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)（圖6）。由圖6 可知，6 個(gè)樣本與GenBank 檢索到的Trichuris rhinopiptheroxella處于同一分支，同源性為100%，所在分支與其他毛首線蟲(chóng)所在分支距離較遠(yuǎn)。

3 討論

圖6 基于cox1 基因序列以NJ 法所構(gòu)建的金絲猴毛首線蟲(chóng)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

寄生蟲(chóng)的準(zhǔn)確分類(lèi)鑒定對(duì)寄生蟲(chóng)病防治具有重要意義。但單靠傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法已經(jīng)不能準(zhǔn)確高效地進(jìn)行寄生蟲(chóng)分類(lèi)鑒定。形態(tài)學(xué)分類(lèi)方法存在一定局限性，尤其對(duì)于相似種或者近緣種，很難從形態(tài)上進(jìn)行區(qū)分，而分子生物學(xué)的發(fā)展很好地解決了這一問(wèn)題。線粒體cox1作為線粒體編碼基因，具有母系遺傳、進(jìn)化速度快、受基因突變影響小等特點(diǎn)，被很多專(zhuān)家學(xué)者認(rèn)為是種內(nèi)遺傳學(xué)、分子分類(lèi)學(xué)、分子進(jìn)化學(xué)等學(xué)科理想的遺傳標(biāo)記[14-17]。

本研究以長(zhǎng)沙生態(tài)動(dòng)物園金絲猴體內(nèi)采集的毛首線蟲(chóng)為樣本進(jìn)行序列比對(duì)。發(fā)現(xiàn)分離的6 條金絲猴毛首線蟲(chóng)種內(nèi)相似性很高（100%），同時(shí)與GenBank 上檢索的Trichuris rhinopiptheroxella相似性也為100%，而與其他毛首線蟲(chóng)種間差異較大，為24.0%～34.1%。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，毛首線蟲(chóng)分離株與GenBank 上檢索的Trichuris rhinopiptheroxella處于同一分支，而與其他毛首線蟲(chóng)分枝相隔較遠(yuǎn)。依此判定，此次在長(zhǎng)沙生態(tài)動(dòng)物園金絲猴體內(nèi)采集的毛首線蟲(chóng)均為T(mén)richuris rhinopiptheroxella。此次研究結(jié)果充分說(shuō)明毛首線蟲(chóng)的cox1基因序列種內(nèi)保守而種間差異大，可以作為毛首線蟲(chóng)分類(lèi)學(xué)理想的遺傳標(biāo)記，還為進(jìn)一步研究毛首線蟲(chóng)的群體遺傳結(jié)構(gòu)奠定了基礎(chǔ)。