張青，李慧素，吳寧鵬，彭麗，吳志明*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，鄭州 450002；2.河南省獸藥飼料監(jiān)察所，鄭州 450008)

多西環(huán)素(Doxycycline)是由鏈霉菌產(chǎn)生的四環(huán)素類抗生素，對(duì)革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌均有抑制作用，具有高效、廣譜、長效等優(yōu)點(diǎn)，在獸醫(yī)臨床中被廣泛用于防治畜禽支原體病、大腸桿菌病、沙門氏菌病、巴氏桿菌病、布氏桿菌病及細(xì)菌引起的呼吸道感染等疾病[1]。然而，在養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)中存在超劑量、超范圍等不合理使用和不遵守休藥期的現(xiàn)象，造成了耐藥菌株的出現(xiàn)和畜禽產(chǎn)品中藥物殘留超標(biāo)的問題。多西環(huán)素在動(dòng)物源食品中殘留，會(huì)對(duì)人體的肝臟、牙齒和骨骼等造成損害，給人類的健康造成潛在危害[2-3]。因此，我國和歐盟均規(guī)定多西環(huán)素在家禽組織中最大殘留限量(Maximum residue limit,MRL)為100～600 μg/kg[4]。目前，國內(nèi)外關(guān)于多西環(huán)素藥物殘留檢測主要是水產(chǎn)品、牛奶[5]、雞蛋[6]及部分家畜的肌肉[7]、肝臟組織[8]中殘留量測定，未見腎臟和皮+脂組織中多西環(huán)素殘留量測定方法的報(bào)道，現(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)方法中組織也涵蓋不全。本研究旨在建立一種高效液相色譜法，可以同時(shí)測定雞的肌肉、肝臟、腎臟和皮+脂等組織中多西環(huán)素殘留量，以期為全面監(jiān)控雞組織中多西環(huán)素殘留提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器 高效液相色譜儀Waters 2695，配Waters 2487檢測器，美國Waters公司；臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)，美國Sigma公司；電子天平(感量0.00001 g和0.01 g)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；IKA MS3 basic漩渦儀，艾卡(廣州)儀器設(shè)備有限公司(IKA中國)；Milli-QA10 超純水儀，美國MiLipore 公司；TTL-DCⅡ型氮吹儀，美國Organomation Associates公司；固相萃取裝置，美國Waters公司；微量加樣器：美國Eppendorf 公司。

1.2 試劑與材料 多西環(huán)素對(duì)照品，含量：85.2%，批號(hào)：K0131507，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。甲醇和乙腈，色譜純，均購自德國Merck公司；三氟乙酸、二氯甲烷、乙二胺四乙酸二鈉、枸櫞酸、磷酸氫二鈉、草酸、硫酸、鎢酸鈉等，均為分析純，購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。HLB固相萃取柱(6cc，500 mg)，購自美國Waters公司。定性濾紙(快速)，購自杭州沃華公司。

1.3 溶液的配制

1.3.1 1 mg/mL多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)貯備液 準(zhǔn)確稱取相當(dāng)于多西環(huán)素10 mg的多西環(huán)素對(duì)照品，于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成濃度為1 mg/mL的多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)貯備液，于-20 ℃以下保存，有效期1個(gè)月。

1.3.2 10 μg/mL多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)工作液 準(zhǔn)確量取1.3.1項(xiàng)下溶液1 mL，于100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容，配制成濃度為10 μg/mL的多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.3 Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液 分別取一水檸檬酸12.9 g，十二水磷酸氫二鈉27.6 g，二水乙二胺四乙酸二鈉37.2 g，加水900 mL溶解，用1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH至4.0，加水稀釋至1000 mL，混勻。

1.3.4 0.01 mol/L草酸溶液 取草酸1.26 g，用水溶解并稀釋至1000 mL。

1.3.5 30%甲醇草酸溶液 取甲醇30 mL，加0.01 mol/L草酸溶液稀釋至100 mL。

1.3.6 0.34 mol/L硫酸溶液 取硫酸1.85 mL，用水溶解并稀釋至100 mL。

1.3.7 7%鎢酸鈉溶液 取鎢酸鈉7 g，用水溶解并稀釋至100 mL。

1.3.8 0.01 mol/L三氟乙酸水溶液 取三氟乙酸0.8 mL，用水溶解并稀釋至1000 mL，配制成0.01 mol/L三氟乙酸水溶液。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 樣品前處理 肌肉、肝臟和腎臟：稱取試料5.0 g于50 mL離心管中，加Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液20 mL，渦旋1 min，振蕩10 min，加0.34 mol/L硫酸溶液5 mL、7%鎢酸鈉溶液5 mL，渦旋1 min，8500 r/min離心5 min，取上清液。殘?jiān)謩e加Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液20 mL和10 mL，渦旋1 min，振蕩10 min，8500 r/min離心5 min，重復(fù)提取兩次。合并三次上清液，濾紙過濾后，備用。

皮+脂：稱取試料5.0 g于50 mL離心管中，加二氯甲烷15 mL，渦旋1 min，振蕩5 min，加Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液15 mL，渦旋1 min，振蕩5 min，8500 r/min離心5 min，取上層溶液。下層溶液加Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液15 mL萃取，取上層溶液，重復(fù)兩次。合并三次上層溶液，濾紙過濾后，備用。

HLB柱依次用甲醇5 mL、水5 mL和Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液5 mL活化，取備用液過柱，待全部備用液流出后，依次用水10 mL、5%甲醇溶液10 mL淋洗，抽干，用甲醇6 mL洗脫，收集全部洗脫液于刻度試管中，抽干，于40 ℃水浴氮?dú)獯抵良s1.0 mL，用0.01 mol/L草酸溶液定容至2.0 mL，過濾，供高效液相色譜測定。

1.4.2 色譜條件 色譜柱：Waters Xbrige C18柱(150 mm×4.6 mm，粒徑5 μm)；流動(dòng)相A：0.01 mol/L三氟乙酸水溶液，B：乙腈；梯度洗脫，見表1；檢測波長：350 nm；進(jìn)樣量：50 μL；柱溫：30 ℃。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫Tab 1 Mobile phase compositions for gradient elution

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確量取多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)工作液適量，用30%甲醇草酸溶液稀釋成濃度為0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，從低濃度到高濃度依次進(jìn)樣，供高效液相色譜測定。以測得峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.4.4 檢測限與定量限 按1.4.1項(xiàng)樣品前處理方法處理樣品，再按1.4.2項(xiàng)液相色譜條件進(jìn)行分析測定。依照信噪比S/N≥3為檢測限(Limit of detection,LOD)，S/N≥10為定量限(Limit of quantification,LOQ)。

1.4.5 精密度與準(zhǔn)確度 取空白雞組織樣品，以定量限和最大殘留限量為依據(jù)，添加4個(gè)不同濃度(LOQ、1/2MRL、MRL、2MRL)的多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.4.1項(xiàng)樣品前處理方法處理樣品，再按1.4.2液相色譜條件進(jìn)行HPLC分析測定，每個(gè)濃度5個(gè)平行樣品，進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)。求回收率和批內(nèi)、批間變異系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 在0.05～5 μg/mL的濃度范圍內(nèi)，多西環(huán)素色譜峰面積與濃度呈線性相關(guān)，回歸方程為y=81.63x+22461.60，權(quán)重是1/x2，相關(guān)系數(shù)r大于0.999，見圖1。

圖1 多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig 1 Standard curve of doxycycline solution

2.2 檢測限與定量限 按照信噪比S/N≥3為檢測限，S/N≥10為定量限，求得雞各組織中多西環(huán)素的檢測限分別為肌肉20 μg/kg，肝臟、腎臟和皮+脂50 μg/kg；定量限分別為肌肉50 μg/kg，肝臟、腎臟和皮+脂100 μg/kg，色譜圖見圖2～圖10。

圖2 多西環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖(100 μg/L)Fig 2 Chromatogram of doxycycline standard solution(100 μg/L)

圖3 雞肉組織空白色譜圖Fig 3 Chromatogram of blank chicken muscles

圖4 雞肉組織空白添加50 μg/kg多西環(huán)素色譜圖Fig 4 Chromatogram of doxycycline 50 μg/kg added in chicken muscles

圖5 雞肝臟組織空白色譜圖Fig 5 Chromatogram of blank chicken livers

圖6 雞肝臟組織空白添加100 μg/kg多西環(huán)素色譜圖Fig 6 Chromatogram of doxycycline 100 μg/kg added in chicken livers

圖7 雞腎臟組織空白色譜圖Fig 7 Chromatogram of blank chicken kidneys

圖8 雞腎臟組織空白添加100 μg/kg多西環(huán)素色譜圖Fig 8 Chromatogram of doxycycline 100 μg/kg added in chicken kidneys

圖9 雞皮+脂組織空白色譜圖Fig 9 Chromatogram of blank chicken skin with fat

圖10 雞皮+脂組織空白添加100 μg/kg多西環(huán)素色譜圖Fig 10 Chromatogram of doxycycline 100 μg/kg added in chicken skin with fat

2.3 精密度與準(zhǔn)確度 從表2～表5可以看出，多西環(huán)素在肌肉組織50 ～200 μg/kg添加濃度范圍，平均回收率為63.42%～81.11%，批內(nèi)變異系數(shù)為2.2%～9.9%，批間變異系數(shù)為5.7%～9.0%；在肝臟組織100 ～600 μg/kg添加濃度范圍，平均回收率為62.32%～84.92%，批內(nèi)變異系數(shù)為1.2%～11.5%，批間變異系數(shù)為6.3%～9.0%；在腎臟組織100 ～1200 μg/kg添加濃度范圍，平均回收率為90.40%～90.90%，批內(nèi)變異系數(shù)為1.5%～13.5%，批間變異系數(shù)為5.0%～14.1%；在皮+脂組織100 ～600 μg/kg添加濃度范圍，平均回收率為70.77%～74.6%，批內(nèi)變異系數(shù)為0.7%～6.8%，批間變異系數(shù)為1.4%～4.8%。

表2 雞肉中添加多西環(huán)素的回收率測定結(jié)果Tab 2 Recovery rate and precision of doxycycline added in chicken muscles

表3 雞肝臟中添加多西環(huán)素的回收率測定結(jié)果Tab 3 Recovery rate and precision of doxycycline added in chicken livers

表4 雞腎臟中添加多西環(huán)素的回收率測定結(jié)果Tab 4 Recovery rate and precision of doxycycline added in chicken kidneys

表5 雞皮+脂中添加多西環(huán)素的回收率測定結(jié)果Tab 5 Recovery rate and precision of doxycycline added in chicken skin with fat

3 討論與結(jié)論

3.1 方法的選擇 目前國內(nèi)外多西環(huán)素殘留檢測方法常用的有酶聯(lián)免疫法(ELISA)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)、液相色譜法(HPLC)等。其中，ELISA法操作簡單、省時(shí)、靈敏度高，但存在一定的交叉反應(yīng)，易出現(xiàn)假陽性[9-10]，結(jié)果需要其他方法進(jìn)行確證；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)[11-13]的特點(diǎn)，但存在基質(zhì)效應(yīng)、前處理操作復(fù)雜、定量不準(zhǔn)等問題，在實(shí)際應(yīng)用中受到一定的限制；高效液相色譜法具有簡單、快捷、準(zhǔn)確等特點(diǎn)[14-16]，是目前四環(huán)素類藥物分析檢測最普遍的方法，而高效液相色譜-紫外檢測法是中國獸藥典、多項(xiàng)國家標(biāo)準(zhǔn)及行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)常用的方法，也是多西環(huán)素藥物檢測中最經(jīng)典的方法。因此，選擇高效液相色譜-紫外檢測法測定雞組織中的多西環(huán)素殘留量，提高了方法的靈敏度、準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性，為控制可食性雞組織中多西環(huán)素的殘留提供可靠的方法保證。

3.2 色譜條件的優(yōu)化 通過比較常用的甲醇-乙腈-草酸、三氟乙酸-甲醇、三氟乙酸溶液-乙腈等四環(huán)素類藥物測定流動(dòng)相體系，發(fā)現(xiàn)0.01 mol/L三氟乙酸溶液-乙腈作為流動(dòng)相，梯度洗脫，可避免多西環(huán)素色譜峰展寬和出峰較早易受到雜質(zhì)峰干擾等問題。同時(shí)，采用多西環(huán)素兩個(gè)最大吸收波長270 nm和350 nm進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)選擇350 nm為檢測波長，可避免樣品中雜質(zhì)對(duì)多西環(huán)素的干擾，同時(shí)可獲得較高的響應(yīng)值，提高方法的靈敏度。

3.3 固相萃取柱的選擇 組織中的多西環(huán)素用Na2EDTA-Mcllvaine緩沖液提取，造成樣品提取液中存在較多的極性雜質(zhì)，與多西環(huán)素極性相似，進(jìn)一步凈化時(shí)不能用液-液分配方法進(jìn)行凈化。故分別選擇HLB、C18、MAX、HLB-PRS、HLB-COOH等固相萃取柱進(jìn)行考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，C18柱和HLB柱二者均能較好的凈化樣品，但C18柱在使用時(shí)會(huì)因吸附劑干涸、pH值等問題造成結(jié)果重現(xiàn)性差。因此，本方法采用HLB固相萃取柱進(jìn)行凈化處理，有效去除蛋白和內(nèi)源性雜質(zhì)，減少了雜質(zhì)干擾，提高了方法的準(zhǔn)確度和精密度。

3.4 皮+脂組織提取方法優(yōu)化 由于多西環(huán)素具有較強(qiáng)的極性，采用Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液直接提取皮+脂組織中的多西環(huán)素時(shí)，容易出現(xiàn)提取不完全、回收率低等問題。參考相關(guān)文獻(xiàn)[17]，選擇非極性溶劑將脂肪組織溶解，再用液-液萃取法進(jìn)行反相萃取。通過比較叔丁基甲醚、正己烷、乙腈、丙酮和二氯甲烷等有機(jī)溶劑，發(fā)現(xiàn)二氯甲烷可以將脂肪組織充分溶解，再用Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液反相萃取兩次，才能將皮+脂組織中多西環(huán)素完全萃取至緩沖溶液中，從而提高提取效率，準(zhǔn)確測定皮+脂組織中多西環(huán)素的殘留量。

本文建立了高效液相色譜法測定雞四種組織中多西環(huán)素殘留量的方法，特異性強(qiáng)，準(zhǔn)確度高，精密度好，可滿足雞組織中多西環(huán)素殘留量的檢測，為動(dòng)物性食品中多西環(huán)素殘留監(jiān)控提供了檢測依據(jù)。