脂蛋白腎病腎臟組織油紅O染色方法改良

馬依依，屈 磊，張 帆，喻小娟，王素霞，楊 莉

脂蛋白腎病是一種罕見的由ApoE基因突變引起的常染色體隱性遺傳疾病。ApoE為低密度脂蛋白受體，其突變不僅可引起血清中β脂蛋白前體、β脂蛋白和ApoE升高，還可導(dǎo)致Ⅲ型高脂血癥，而Ⅲ型高脂血癥患者的腎小球損傷病理改變與脂蛋白腎病相同[1-2]。該病突出表現(xiàn)為腎小球毛細(xì)血管腔內(nèi)脂質(zhì)沉積，腎小球毛細(xì)血管腔內(nèi)的脂蛋白栓在經(jīng)10%中性福爾馬林固定、石蠟切片，僅在PAS染色下有淡染色，確診脂蛋白腎病需冷凍組織油紅O或蘇丹紅染色陽性，該陽性物質(zhì)為脂蛋白[3-4]。因此，針對(duì)脂蛋白栓的染色在診斷脂蛋白腎病中非常重要。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)比三種不同油紅O染色方法(粉末油紅O、經(jīng)60%異丙醇處理的粉末油紅O、改良版油紅O)，探索脂蛋白腎病患者腎組織油紅O染色的較優(yōu)染色方法，為臨床病理診斷提供快速且準(zhǔn)確的病理技術(shù)服務(wù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本選取2018～2019年北京大學(xué)第一醫(yī)院腎內(nèi)科臨床病理確診的2例脂蛋白腎病。腎穿刺活檢冷凍組織5 μm厚切片。

1.2 配制試劑油紅O染液：0.05 g油紅O粉末(Sigma Aldrich)室溫溶于100 mL 50%乙醇，過濾。改良油紅O染液：按照試劑盒說明書將Oil red O stain A與Oil red O stain B(Solarbio)以3 ∶2比例混合均勻，室溫靜置10 min。

1.3 方法

1.3.1油紅O染色法 (1)將冷凍切片取出室溫放置20 min。(2)將恢復(fù)至室溫的冷凍切片浸入配制的油紅O染液中浸染15 min。(3)去離子水終止反應(yīng)。(4)滴加蘇木精至完全覆蓋腎組織，滴染2 min。(5)去離子水洗。(6)浸入1%碳酸鋰5 s進(jìn)行返藍(lán)。(7)甘油封片，光鏡下觀察。

1.3.2經(jīng)60%異丙醇處理的油紅O染色法 (1)將冷凍切片取出室溫放置20 min。(2)將恢復(fù)室溫的冷凍切片浸入60%異丙醇20～30 s進(jìn)行預(yù)處理。(3)預(yù)處理后，直接將冷凍切片浸入事先配置好的油紅O染液中浸染15 min。(4)插入60%異丙醇中洗去浮色。(5)滴染蘇木精2 min。(6)去離子水中浸洗多余浮色。(7)浸入1%碳酸鋰5 s進(jìn)行返藍(lán)。(8)甘油封片，光鏡下觀察。

1.3.3改良油紅O染色法 (1)將冷凍切片取出室溫放置20 min。(2)將恢復(fù)至室溫的冷凍切片浸入60%異丙醇20～30 s進(jìn)行預(yù)處理。(3)預(yù)處理后，直接將冷凍切片浸入事先配制好的改良油紅O染液中，密閉染色15 min。(4)將冷凍切片浸入60%異丙醇中洗去浮色。(5)浸入去離子水中洗去異丙醇。(6)滴染蘇木精2 min。(7)去離子水中浸洗多余浮色。(8)浸入1%碳酸鋰返藍(lán)5 s。(9)甘油封片，光鏡觀察。

2 結(jié)果

油紅O染色結(jié)果顯示：腎小球毛細(xì)血管腔內(nèi)、系膜區(qū)可見淡染橙紅色的脂滴(圖1A)。經(jīng)60%異丙醇處理油紅O染色結(jié)果顯示：腎小球毛細(xì)血管腔內(nèi)、系膜區(qū)可見淺染橘色的脂滴，細(xì)胞核呈淡藍(lán)色，輪廓較粉末油紅O清晰(圖1B)。改良油紅O染色結(jié)果顯示：腎小球毛細(xì)血管腔內(nèi)、系膜區(qū)和部分腎小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見深染紅色的脂滴，明顯區(qū)別于呈淡染的藍(lán)色細(xì)胞核，且邊界清晰(圖1C)。

ABC圖1 A.油紅O染色;B.經(jīng)60%異丙醇處理的油紅O染色;C.改良油紅O染色

3 討論

脂蛋白腎病患者主要為亞裔人群(中國人、日本人)[5]，男性多于女性，男 ∶女為1.5 ∶1；主要見于成人，診斷時(shí)中位年齡31.5歲，但兒童也可見[6]；臨床主要表現(xiàn)為蛋白尿，可出現(xiàn)腎病綜合征，并呈激素抵抗。其病理改變主要為光鏡下腎小球毛細(xì)血管腔內(nèi)脂質(zhì)沉積、系膜細(xì)胞和基質(zhì)增生，可出現(xiàn)系膜溶解，毛細(xì)血管壁增厚、斷裂。福爾馬林固定組織制備的石蠟切片在光鏡下僅可見毛細(xì)血管腔內(nèi)淡染“血栓”，其原因?yàn)槭炃衅?jīng)二甲苯和無水乙醇浸泡后脂質(zhì)已溶解消失。因此，確診脂蛋白腎病需在冷凍切片上顯示毛細(xì)血管腔內(nèi)脂滴。具體方法有油紅O、尼羅紅、蘇丹紅、鋨酸染色；其中油紅O與脂質(zhì)的親和力較強(qiáng)、著色較深，顯示脂滴位置清晰，與組織背景區(qū)分明確，油紅O染色比其他染色方法穩(wěn)定、操作簡單、可重復(fù)性強(qiáng)[6-10]，因此臨床最常用油紅O染色幫助診斷脂蛋白腎病。

冷凍切片用于免疫組化染色通常厚度為2～3 μm，本實(shí)驗(yàn)油紅O染色腎組織冷凍切片厚度為5 μm，目的是盡可能多地獲取脂質(zhì)，染色效果更明顯，形態(tài)更清晰。本實(shí)驗(yàn)三種油紅O染色方法皆可用于脂蛋白腎病的診斷，但在染色效果上有所差異。與油紅O染液相比，改良油紅O染液與經(jīng)60%異丙醇處理油紅O染液兩種染色腎組織中脂滴位置明確、輪廓清晰，未見明顯移位，腎臟組織細(xì)胞核顏色鮮艷且輪廓清晰，并且切片背景更干凈，無明顯的橙黃色背景。油紅O染液脂滴位置相對(duì)明確，但有明顯移位且界限不清，細(xì)胞核顏色暗淡且輪廓模糊，組織背景較高且顏色偏橙黃色。其效果存在差異的原因可能與60%異丙醇預(yù)處理有關(guān)，異丙醇除起到固定脂質(zhì)的作用外，還可消除非特異染色背景。

三種染色方法對(duì)于脂滴的著色程度也有明顯不同，改良油紅O染色脂滴呈鮮艷的紅色，油紅O染色脂滴呈橙色，經(jīng)60%異丙醇處理油紅O染色則為淡染的橘色。原因可能為經(jīng)60%異丙醇處理油紅O染液中的異丙醇溶解組織中部分脂肪、沉積量減少有關(guān)。改良油紅O染色雖然也經(jīng)60%異丙醇處理，組織中脂肪雖部分溶解，但改良油紅O染液中可能含有與異丙醇高度親和的成分，從而使經(jīng)過異丙醇預(yù)處理的脂質(zhì)呈鮮艷的紅色。

綜上所述，對(duì)于腎臟冷凍組織，改良油紅O染液染色方法明顯優(yōu)于油紅O染液和經(jīng)60%異丙醇處理的油紅O染液，其原因可能與冷凍組織是否經(jīng)過60%異丙醇預(yù)處理以及染液中是否含有與異丙醇高度親和的成分有關(guān)。改良油紅O染液染色方法穩(wěn)定性高，操作簡單，染色鮮艷清晰，非特異性背景低，為脂蛋白腎病的病理診斷提供了穩(wěn)定且可靠的染色技術(shù)。