張玉換，徐杰，余鵬飛，黃榮博，何曉明，周煒，趙月鈞*

(1.綠城農(nóng)科檢測技術(shù)有限公司，浙江 杭州 310051；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，浙江 杭州 310021；3.浙江省動物疫病預(yù)防控制中心，浙江 杭州 311119)

隨著畜禽業(yè)規(guī)?；B(yǎng)殖的發(fā)展，獸藥抗生素濫用現(xiàn)象頻頻發(fā)生。畜禽動物體本身對藥物的吸收量有限，更多的藥物會隨其糞便、尿液排出體外，進(jìn)入環(huán)境。隨著有機(jī)綠色農(nóng)業(yè)的興起，這種以動物糞便為原料的有機(jī)肥在種植業(yè)中被廣泛使用[1-3]。由于現(xiàn)有的有機(jī)肥處理技術(shù)有限，往往在售的有機(jī)肥無法完全去除或降解原有的獸藥殘留，這些高含量的有機(jī)肥一旦用于農(nóng)田，會對其土壤造成嚴(yán)重污染。

磺胺類藥物是目前較為常見的廣譜類藥物。目前關(guān)于有機(jī)肥中磺胺類檢測常用的檢測儀器為液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜，最為常見的前處理方法是使用緩沖鹽提取，通過超聲、固相萃取凈化，或者直接使用加速溶劑萃取儀提取凈化[1，4-7]?，F(xiàn)有方法相對來說操作較為復(fù)雜，成本也較高，對于大批量檢測性價比不高。本試驗旨在研究出更為經(jīng)濟(jì)、簡捷、快速、準(zhǔn)確的檢測前處理方法。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑和材料

TSQ Quantum液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(美國Thermo Fisher Scientific公司)；KQ-50型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器公司)；QT-2型旋渦混合器(上海琪特分析儀器有限公司)；色譜純乙腈和甲醇(美國Merck公司)；試驗用水為去離子水；無水硫酸鎂、氯化鈉、50 μm 60? C18粉末、40～60 μm丙基乙二胺粉末(PSA)(上海凌峰有限公司)；優(yōu)級純甲酸銨和甲酸(西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司)；0.22 μm有機(jī)濾膜；19種(磺胺醋酰、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲噁唑、磺胺-5-甲氧嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺氯噠嗪、磺胺甲噁唑、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺異噁唑、磺胺鄰二甲氧嘧啶、苯甲?；前?、磺胺苯吡唑、磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于99.0%)磺胺標(biāo)準(zhǔn)品購自德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。

1.2 方法

稱取試樣3.00 g于50 mL離心管中，加入10 mL一級水室溫浸泡30 min，再加入0.1%甲酸乙腈溶液15 mL，渦旋1 min混勻，超聲15 min提取，再加6 g 無水硫酸鎂和1.5 g 氯化鈉，渦旋30 s，8 000 r·min-1離心3 min。取1 mL上清液并依次加入150 mg無水硫酸鎂、100 mg C18、20 mg PSA凈化，渦旋30 s，10 000 r·min-1離心3 min。移取500 μL上清液加水定容至1.0 mL，渦旋混勻，過0.22 μm濾膜，待測。

1.3 色譜質(zhì)譜條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱為ACQUITY UPLC?BEH C18 (100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量5 μL；流速0.20 mL·min-1；洗脫梯度見表1。在此條件下19種磺胺保留時間詳見表2。

表1 19種磺胺類藥物的液相色譜梯度洗脫條件

1.3.2 質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧離子源(ESI)；掃描方式為正離子掃描；采集方式為多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式，其定性離子和定量離子的選擇及碰撞能量見表2；噴霧電壓5 500 V；毛細(xì)管溫度450 ℃；霧化氣、氣簾氣和碰撞氣均為氮氣。

表2 19種磺胺保留時間及質(zhì)譜多重反應(yīng)監(jiān)測(MRM)條件

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理提取劑的選擇

對于土壤、畜禽糞便等基質(zhì)中磺胺類藥物的測定，目前該藥物檢測的前處理方法多采用緩沖溶液和有機(jī)溶劑混合液提取，以萃取柱凈化。相對來說傳統(tǒng)的前處理處理時間耗時較長。目前，多篇文獻(xiàn)報道采用QuEChERS(quick，easy，cheap，effective，rugged and safe)法測定肌肉、蛋、飼料中的磺胺類殘留，主要采用酸化乙腈提取，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定[4，8-13]。較為常見的提取試劑有甲醇、乙腈、乙酸乙酯等，因乙腈除蛋白、除糖等雜質(zhì)效果優(yōu)于甲醇、乙酸乙酯，且滿足液質(zhì)直接進(jìn)樣的要求，故選乙腈作為主要有機(jī)提取試劑。根據(jù)相關(guān)研究報道[8-9,11]，加入一定量的酸可提高目標(biāo)物的提取效率?；诖耍痉椒ú捎?%甲酸酸化乙腈溶劑為提取試劑。

2.2 樣品前處理凈化劑的選擇

QuEChERS常見采用無水MgSO4、PSA、C18及GCB凈化，其中無水MgSO4用于除去提取液中多余的水分，PSA、C18與GCB常用于除色素、除糖等雜質(zhì)。本文將150 mg無水MgSO4與其他3種凈化劑各100 mg相結(jié)合，通過觀察凈化后的狀態(tài)與回收率，比較不同凈化吸附劑的凈化效果。由表3可知，150 mg MgSO4+100 mg C18的凈化效果最佳，所測化合物回收率范圍為86.9%～97.6%；另外2種組合的磺胺噻唑和磺胺二甲噁唑的回收低于80%。因此，選擇150 mg無水MgSO4與100 mg C18組合為基礎(chǔ)凈化劑。

表3 不同吸附劑組合凈化條件下有機(jī)肥中19種磺胺類藥物的回收率

從凈化液的顏色上看，用C18凈化后的樣品溶液仍呈淡黃色透明液體，而用PSA、GCB凈化后的樣品溶液澄清透明。由此可知，C18的除色素能力弱于PSA、GCB，而PSA與GCB的凈化效果較為明顯。若只用C18作為凈化劑，對于有機(jī)肥類基質(zhì)較為復(fù)雜的樣品在儀器上會存在較強的基質(zhì)效應(yīng)。

從經(jīng)濟(jì)的角度考慮，選擇PSA與C18結(jié)合使用可減少基質(zhì)干擾。在使用100 mg C18的基礎(chǔ)上，考察不同PSA添加量的凈化效果，回收率結(jié)果詳見表4。結(jié)果表明，在10～40 mg的PSA添加量與100 mg C18混合，回收率均能滿足70%～120%的要求。其中，當(dāng)PSA的量超過30 mg時，磺胺噻唑和磺胺二甲噁唑的回收率偏低，值小于80%；添加10 mg與20 mg的PSA，樣品回收率均在80%以上，考慮20 mg的PSA凈化后的去除基質(zhì)干擾的效果優(yōu)于10 mg，故本試驗凈化劑最終選擇為150 mg無水MgSO4+100 mg C18+20 mg PSA混合。

表4 加入不同PSA量條件下有機(jī)肥中19種磺胺類藥物的回收率

2.3 方法標(biāo)準(zhǔn)曲線

取19種混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，分別用處理后豬糞、雞糞、牛糞為原料發(fā)酵的空白有機(jī)肥過膜后溶液逐級稀釋配制濃度為0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10、50、100和200 μg·L-1的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

LC-MS/MS分析后以定量離子對峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，磺胺類藥物在0.1～200 μg·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2>0.99。

2.4 檢出限和定量限的確定

在有機(jī)肥中添加19種磺胺類藥品，使其在樣品中的濃度為20 μg·kg-1，上機(jī)后測得定性和定量離子對信噪比(S/N)值，計算后，以S/N值為3的濃度為樣品中該方法的檢出限，S/N值為10的濃度為該方法的定量限。由此得到磺胺醋酰、磺胺噻唑、磺胺甲噻二唑、磺胺氯噠嗪的檢出限為6 μg·kg-1，定量限為20 μg·kg-1；其他15種磺胺類藥物的檢出限為3 μg·kg-1，定量限為10 μg·kg-1。

2.5 方法的準(zhǔn)確度與精密度驗證

選擇豬糞源、雞糞源與牛糞源3種不同來源的有機(jī)肥為檢測對象，做3因素6水平添加回收試驗，計算得到最終的加標(biāo)回收率及方法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)值。由表5可知，用優(yōu)化后的前處理方法做3種不同來源的有機(jī)肥加標(biāo)回收，回收率均能滿足70%～120%的要求，RSD均在15%以內(nèi)，滿足試驗方法要求。說明本方法能滿足有機(jī)肥中19種磺胺類藥物含量測定需要。

表5 不同源有機(jī)肥三因素六水平添加回收試驗

2.6 實際樣品檢測

為驗證方法的適用性，同時對10個不同來源的有機(jī)肥進(jìn)行檢測，檢出率20%。其中，24.9 μg·kg-1磺胺喹惡啉在1個豬糞源有機(jī)肥中有檢出，同時該樣品還檢出磺胺二甲嘧啶和磺胺喹惡啉，但這兩種物質(zhì)的檢出濃度低于本方法的定量限；除豬源性樣品中有檢出外，在雞源性樣品中也檢出磺胺二甲嘧啶87.7 μg·kg-1，磺胺間甲氧嘧啶201.5 μg·kg-1。

3 小結(jié)

經(jīng)優(yōu)化前處理后的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測有機(jī)肥中19種磺胺的方法具有簡便、快捷、準(zhǔn)確的特點。能大幅度提高有機(jī)肥樣品的定性定量檢測。