豬繁殖與呼吸綜合征病毒在豬肺組織精細(xì)切片中感染特性的研究

崔紅亮，張洪亮，汪孟航，賈梅玉，孟凡丹*，蔡雪輝*

（1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春 130118；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150069）

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的重要病毒性傳染病，能夠引起妊娠母豬早產(chǎn)、流產(chǎn)以及產(chǎn)死胎，同時(shí)還可造成仔豬呼吸障礙[1]。該病在全球范圍內(nèi)的主要養(yǎng)豬國家流行并暴發(fā)，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前關(guān)于PRRSV 的分離、毒力測定等主要集中在利用傳代細(xì)胞、原代肺泡巨噬細(xì)胞（PAM）以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)作研究。肺組織精細(xì)切片（PCLS）作為一種呼吸系統(tǒng)體外培養(yǎng)體系，可以在體外高度重現(xiàn)肺臟組織在動(dòng)物體內(nèi)環(huán)境中的多種生物學(xué)功能與特性，因此是研究呼吸道病原體（病毒和細(xì)菌）在呼吸系統(tǒng)中的感染特性以及宿主天然免疫反應(yīng)的良好工具[2-3]。PCLS 含有呼吸系統(tǒng)中多種類型的細(xì)胞且每種細(xì)胞仍分布于原有的組織結(jié)構(gòu)上，能夠釋放輔助因子以保持其特有的生物學(xué)功能[4]，如纖毛細(xì)胞位于呼吸道上皮表面，呈睫毛狀排列且具有特定方向性擺動(dòng)功能[5]；杯狀細(xì)胞主要分散于柱狀上皮細(xì)胞之間，能夠分泌黏液以維持呼吸道上皮濕潤[6]；PAM主要存在于肺泡以及呼吸道黏膜表面，具有重要的免疫調(diào)節(jié)作用，在天然免疫中扮演著重要角色[7]。因此PCLS 與傳代細(xì)胞相比，在細(xì)胞構(gòu)成和擁有呼吸系統(tǒng)生物學(xué)功能等方面更具有優(yōu)勢。目前國際上已經(jīng)建立了多種動(dòng)物PCLS 體外培養(yǎng)體系，并應(yīng)用于多種呼吸道病原體的體外研究以及相關(guān)藥物的篩選工作[8-9]。因此，為進(jìn)一步了解PRRSV 在呼吸系統(tǒng)中的感染特性，本研究建立了豬PCLS，以及PRRSV在該培養(yǎng)體系中的感染模型，并初步探討了PRRSV在該培養(yǎng)模型中的感染特性。本研究為PRRSV 的體外研究提供了新的模型與方法，同時(shí)也為其它的豬呼吸道病原體提供了新的體外研究平臺(tái)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 PRRSV 分離株（XD-15、WK-34、WK-38、LCL-75、DL-1510、HuN4）、Marc-145細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；3 月齡SPF 豬購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所牧場；低熔點(diǎn)瓊脂糖購自Promega 公司；DMEM 和1640 細(xì)胞培養(yǎng)基、β-微管蛋白抗體購自Sigma 公司；胎牛血清購自CLARK 公司；青霉素和鏈霉素購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所診斷中心；卡那霉素購自北京索萊寶科技有限公司；黏蛋白抗體購自Vector Laboratories 公司；CD163 蛋白抗體購自Mybiosource 公司；逆轉(zhuǎn)錄酶（PrimeScriptTMRT Master Mix）和熒光定量酶（Premix EX TaqTM）購自TaKaRa 公司；冰凍切片包埋劑購自Leica公司；活/死細(xì)胞染色試劑盒購自US Everbright?Inc.公司；核酸提取試劑盒購自碩世生物科技有限公司。

1.2 豬PCLS 的制備 取3 月齡SPF 豬的新鮮肺臟組織，分別分離5 個(gè)肺小葉，并向各肺小葉中小心注入1.5%低熔點(diǎn)瓊脂糖液，待凝固后制備精細(xì)切片。將制備好的豬PCLS 置于24 孔板中，每孔加入含有青霉素、鏈霉素、卡那霉素和兩性霉素B 等抗生素的新鮮1640 培養(yǎng)基1 mL，于37 ℃，5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每小時(shí)換液1 次，共換液3 次以去除肺臟組織中殘留的低熔點(diǎn)瓊脂糖。

1.3 支氣管上皮纖毛活性評估 首先將1.2 步驟中制備的豬PCLS 中包含的支氣管環(huán)平均分成10 份，按1%～10%計(jì)算每一部分纖毛擺動(dòng)情況，將每部分纖毛擺動(dòng)值相加作為整個(gè)支氣管環(huán)纖毛活性值。在纖毛活性評估試驗(yàn)中，挑選10 張纖毛活性為100%的豬PCLS 進(jìn)行評估試驗(yàn)。每天記錄纖毛活性并換液，連續(xù)記錄10 d。試驗(yàn)重復(fù)3 次。在后續(xù)的所有試驗(yàn)中均選用纖毛活性接近100%的豬PCLS。

1.4 豬PCLS 細(xì)胞活性鑒定選取纖毛活性為100%的豬PCLS 分成若干組置于24 孔板中培養(yǎng)，分別在制備后的第1 d、3 d、7 d 按照活/死細(xì)胞染色試劑盒說明書對豬PCLS 進(jìn)行活/死細(xì)胞染色試驗(yàn)，設(shè)置Triton-X-100 處理過的100%死亡細(xì)胞為陰性對照組，染色后立即用ZEISS 高分辨率激光共聚焦顯微鏡觀察檢測結(jié)果。

1.5 支氣管上皮細(xì)胞與PAM 的間接免疫熒光檢測（IFA）將制備好的豬PCLS 用冰凍切片包埋劑包埋，在液氮中凍結(jié)后，利用冰凍切片機(jī)制備冰凍切片。冰凍切片首先用4%多聚甲醛固定，經(jīng)0.2%Triton-X-100 透膜后，PBS 洗3 次，再用1%牛血清白蛋白（BSA）封閉。然后分2 組進(jìn)行IFA 檢測：第1組室溫孵育β-微管蛋白（1∶300）熒光素標(biāo)記抗體1 h，PBS 洗3 次，再室溫孵育黏蛋白（1∶400）熒光素標(biāo)記抗體1 h，PBS 洗3 次后用含DAPI 的封片劑封片；第2 組室溫孵育PAM 表面標(biāo)志物CD163（1∶100）鼠抗豬抗體1 h，PBS 洗3 次，再孵育羊抗鼠紅色熒光二抗（1∶1 000），PBS 洗3 次，用含DAPI 的封片劑封片。β-微管蛋白和CD163 被標(biāo)記為紅色，黏蛋白被標(biāo)記為綠色，細(xì)胞核被標(biāo)記為藍(lán)色。利用ZEISS高分辨率激光共聚焦顯微鏡觀察檢測結(jié)果。

1.6 PRRSV 感染豬PCLS 及病毒滴度測定分別利用PRRSV 分離株XD-15、WK-34、WK-38、LCL-75、DL-1510 和HuN4 感染豬PCLS，各病毒株感染劑量均為2.5×105TCID50/片，每株病毒感染3 張豬PCLS，所有試驗(yàn)均重復(fù)3 次以上。在37 ℃孵育2 h后，用PBS 洗3 次，加入2.5 mL 新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)，在不同時(shí)間點(diǎn)（0、8 hpi、12 hpi、24 hpi、48 hpi 和72 hpi）收集培養(yǎng)液上清，樣品儲(chǔ)存于-80 ℃條件下。利用Marc-145 細(xì)胞對培養(yǎng)液上清進(jìn)行病毒滴度測定，Reed-Muench 法計(jì)算病毒的TCID50，以取樣時(shí)間點(diǎn)為X 軸，各時(shí)間點(diǎn)病毒TCID50對數(shù)平均值為Y軸，繪制病毒生長曲線。

1.7 感染病毒量的熒光定量PCR 檢測依據(jù)1.6 試驗(yàn)結(jié)果，選擇具有代表性的時(shí)間點(diǎn)（12 hpi、24 hpi和48 hpi），測定PRRSV 各株感染豬PCLS 后培養(yǎng)液上清中的病毒基因拷貝數(shù)。利用核酸提取試劑盒提取病毒RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，根據(jù)文獻(xiàn)[10]中TaqMan 熒光定量PCR 方法檢測病毒基因拷貝數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 支氣管上皮纖毛活性評估連續(xù)記錄10 d豬PCLS支氣管環(huán)纖毛活性，結(jié)果顯示精細(xì)切片制備后的第1 d至第3 d支氣管環(huán)纖毛活性保持為100%，從第4 d開始纖毛活性略有下降，培養(yǎng)到第10 d 纖毛活性仍然能夠保持在95%以上。支氣管上皮細(xì)胞均保持良好的細(xì)胞活性（圖1），表明在豬PCLS 的制備過程以及后續(xù)的體外培養(yǎng)過程對上皮細(xì)胞的生物學(xué)功能影響較小。

圖1 豬PCLS 支氣管纖毛活性評估Fig.1 Ciliary activity assay of bronchus in porcine PCLS

2.2 豬PCLS 細(xì)胞活性鑒定豬PCLS 在制備后進(jìn)行活/死細(xì)胞染色試驗(yàn)，結(jié)果顯示，活細(xì)胞被染成綠色，死細(xì)胞被染成紅色。在豬PCLS 制備后的1 d（圖2A、2E）、3 d（圖2B、2F）和7 d（圖2C、2G）支氣管上皮細(xì)胞和肺泡細(xì)胞幾乎全部為活細(xì)胞，而對照組中所有死亡細(xì)胞均被染成紅色（圖2D、2H）。表明制備后的豬PCLS 中纖毛與肺泡細(xì)胞狀態(tài)良好，且在體外培養(yǎng)條件下仍能保持良好的細(xì)胞活性。

2.3 杯狀細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞和PAM 鑒定分別利用黏蛋白、β-微管蛋白和豬PAM 表面標(biāo)志物CD163 蛋白的熒光素標(biāo)記抗體檢測豬PCLS 支氣管表面黏蛋白的表達(dá)、上皮細(xì)胞完整情況以及PAM 在豬PCLS 中的分布情況。結(jié)果顯示，體外培養(yǎng)的豬PCLS 支氣管上皮細(xì)胞保存完整，纖毛均勻分布于上皮細(xì)胞基頂部（圖3A、3D、3H），該結(jié)果與圖1 所示的纖毛活性評估試驗(yàn)結(jié)果一致。在體外培養(yǎng)的豬PCLS 中杯狀細(xì)胞仍然可以分泌黏蛋白，主要分布于纖毛細(xì)胞之間或分布于支氣管黏膜表面（圖3B、3D、3H）。同時(shí)IFA 結(jié)果還顯示，PAM 主要散在地分布于肺泡組織中（圖3E～3G）。表明豬PCLS 中含有豐富的PAM，因此該培養(yǎng)體系可以用于PRRSV 在呼吸系統(tǒng)中感染特性的研究。

圖2 活/死細(xì)胞染色評估豬PCLS 細(xì)胞活性Fig.2 Vitality of porcine PCLS evaluated by live/dead staining

圖3 黏蛋白、β-微管蛋白和CD163 的免疫熒光染色Fig.3 Immunofluorescence staining of Mucin,β-tubulin and CD163

2.4 PRRSV 在豬PCLS 中生長特性PRRSV 不同分離株感染豬PCLS 后，分別在0、8 hpi、12 hpi、24 hpi、48 hpi 和72 hpi 收集培養(yǎng)液上清，進(jìn)行病毒滴度測定，并繪制各分離株的生長曲線。結(jié)果顯示，各分離株在8 hpi 就可以檢測到少量感染性病毒粒子，其中XD-15 和DL-1510 分離株在24 hpi 病毒滴度達(dá)到最大值，而HuN4、WK-34、WK-38和LCL-75等分離株在48 hpi達(dá)到峰值（圖4）。結(jié)果表明，本試驗(yàn)使用的PRRSV 不同分離株均能夠在豬PCLS 中增殖，但各病毒株之間的增殖速度存在差異。

圖4 PRRSV 在豬PCLS 中的生長曲線Fig.4 Growth curve of PRRSV in porcine PCLS

2.5 PRRSV 在豬PCLS 中基因拷貝數(shù)的檢測結(jié)果用PRRSV 分 離 株HuN4、XD-15、WK-34、WK-38、LCL-75 和DL-1510 感染豬PCLS，依據(jù)2.4 結(jié)果選取最具代表性的時(shí)間點(diǎn)（12 hpi、24 hpi 和48 hpi）收集培養(yǎng)液上清，提取病毒RNA，采用TaqMan 熒光定量PCR 方法檢測病毒基因拷貝數(shù)。

結(jié)果顯示在12 hpi 所有病毒株均可檢測到較高的基因組拷貝水平（圖5），6 株P(guān)RRSV 分離株在肺臟組織中的基因復(fù)制情況與病毒生長曲線相符。進(jìn)一步表明，本試驗(yàn)使用的PRRSV 不同分離株均能夠在豬PCLS 中增殖，但各病毒株之間的增殖速度存在差異。

圖5 病毒基因拷貝數(shù)的熒光定量PCR 檢測Fig.5 Analysis of viral genome copy number by RT-qPCR

3 討 論

PCLS 體外培養(yǎng)體系已被應(yīng)用于多種哺乳動(dòng)物和人的科學(xué)研究中[11]，為解決呼吸道疾病相關(guān)的藥理學(xué)、毒理學(xué)或生理學(xué)問題做出了突出貢獻(xiàn)[12-13]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物存在個(gè)體差異，影響試驗(yàn)的可重復(fù)性，目前缺少應(yīng)用于研究PRRSV 體外感染的模型。建立一種用于PRRSV 研究的體外感染模型，將有利于在體外水平上研究PRRSV 的感染特性和致病機(jī)制。豬PCLS制備方法簡便，能夠在體外條件下連續(xù)培養(yǎng)，并且在體外培養(yǎng)條件下仍能夠很好地維持呼吸系統(tǒng)多種生物學(xué)功能和生理學(xué)結(jié)構(gòu)。豬PCLS 包含多種呼吸系統(tǒng)特有的原代細(xì)胞種類，可應(yīng)用于在體外水平上研究多種呼吸道病原體在呼吸系統(tǒng)中的感染特性[14]。

纖毛擺動(dòng)功能是呼吸道上皮細(xì)胞的重要生物學(xué)功能之一，纖毛活性的評估是評價(jià)豬PCLS 在制備后是否保持正常生物學(xué)功能的重要指標(biāo)之一。通過對制備的豬PCLS 纖毛活性的連續(xù)觀察，表明本實(shí)驗(yàn)制備的豬PCLS 在體外培養(yǎng)條件下可以較長時(shí)間維持呼吸道上皮細(xì)胞的生物學(xué)功能。豬PCLS 包含有多種肺組織特有的細(xì)胞種類，在體外條件下培養(yǎng)較長時(shí)間后，仍然具有較高的活細(xì)胞比例（圖2），可應(yīng)用于后續(xù)的病毒感染性研究。氣管上皮細(xì)胞和杯狀細(xì)胞對于維持支氣管的物理屏障和生理學(xué)功能起到重要作用，通過IFA 檢測β-微管蛋白和黏蛋白表明，本實(shí)驗(yàn)制備的豬PCLS 與正常的支氣管生理結(jié)構(gòu)保持一致。以上結(jié)果證明本研究制備的豬PCLS既具有正常的生理結(jié)構(gòu)，也保持了各種原代細(xì)胞的細(xì)胞活性和生物學(xué)功能。

PRRSV 主要通過呼吸道和生殖道途徑感染豬，豬PAM 主要存在于肺泡以及呼吸道黏膜表面，是PRRSV 在呼吸系統(tǒng)中感染宿主的重要靶細(xì)胞[15-17]。因此，通過對豬PCLS 中PAM 的分布情況進(jìn)行檢測，證明豬PCLS 中存在豐富的PAM，該培養(yǎng)體系可以用于PRRSV 在體外的感染性研究。為了進(jìn)一步探究PRRSV 在呼吸系統(tǒng)中的感染特性，本研究以豬PCLS 為基礎(chǔ)，建立了PRRSV 在呼吸系統(tǒng)中的體外感染模型。利用6 株本實(shí)驗(yàn)室保存的PRRSV 感染豬PCLS，結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)使用的PRRSV 不同分離株均能夠在豬PCLS 中增殖，但各病毒株之間的增殖速度存在差異。這可能與病毒在肺臟中感染的適應(yīng)性以及細(xì)胞嗜性有關(guān)。雖然PRRSV 在豬PCLS 中增殖所產(chǎn)生的感染性病毒粒子的滴度并不是很高，但是檢測病毒RNA 復(fù)制情況的結(jié)果說明，這6 株分離株的RNA 含量最大值均能夠達(dá)到106拷貝/片。值得注意的是，盡管在PRRSV 感染后12 h 就可以檢測到大量的病毒RNA，但是在相同時(shí)間點(diǎn)并不能夠檢測到大量感染性病毒粒子的釋放。除此之外，感染性病毒粒子產(chǎn)生的數(shù)量也與豬PCLS 中存在的PAM 數(shù)量有關(guān)，當(dāng)在豬PCLS 培養(yǎng)體系中增加PAM數(shù)量時(shí)，感染性病毒粒子的數(shù)量也有所升高（數(shù)據(jù)未展示）。

綜上所述，本研究表明豬PCLS 可以用于PRRSV的體外感染研究并且能夠反映出不同病毒株在豬肺組織中的增殖特性。本研究為PRRSV 的體外研究提供新的模型與方法，同時(shí)也為其它豬呼吸道病原體提供了新的體外研究平臺(tái)。