黃芪總黃酮對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7 抗炎免疫的雙向調(diào)節(jié)研究

王 萌，郭 澤，周鴻緣，葛冰潔，王 政，李海濤,2*，張雪梅*

（1. 延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，吉林 延吉 133002；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林 長春 130112）

炎癥是機(jī)體免疫系統(tǒng)受到外界致病因素刺激后發(fā)生的一種復(fù)雜防御反應(yīng)[1-2]。炎癥具有兩面性：適度的炎癥反應(yīng)能夠刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)、促進(jìn)免疫細(xì)胞增殖活化、加快損傷修復(fù)等，益于機(jī)體機(jī)能的增強(qiáng)。而過度的炎癥反應(yīng)則會(huì)造成機(jī)體免疫系統(tǒng)功能紊亂[3]，給機(jī)體帶來損害，甚至可使機(jī)體器官衰竭導(dǎo)致死亡[4]。所以炎癥和免疫反應(yīng)二者是相互關(guān)聯(lián)的過程，參與炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子、發(fā)生作用的機(jī)制通常都要受到機(jī)體免疫機(jī)制的調(diào)控。巨噬細(xì)胞（Macrophages，Mφ）是遍及機(jī)體血液、淋巴和組織中的一種免疫效應(yīng)細(xì)胞[5]，其作為免疫系統(tǒng)的重要效應(yīng)細(xì)胞，在宿主免疫應(yīng)答和宿主防御多種病原的感染中發(fā)揮著重要作用。其一方面具有抗原遞呈、吞噬病原體、分泌多種細(xì)胞因子、激活免疫反應(yīng)等生物學(xué)活性，另一方面通過釋放各種炎癥因子、參與炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，加劇炎癥的發(fā)生[6-8]。因此，巨噬細(xì)胞被認(rèn)為是多種免疫調(diào)節(jié)和抗炎藥物的靶細(xì)胞。

目前臨床上采用的抗炎藥物多為西藥，其副作用大，易產(chǎn)生抗藥性、藥物依賴性、損害機(jī)體功能等不良反應(yīng)。而中藥具有低毒低耐藥性、藥食同兼、應(yīng)用靈活等優(yōu)勢(shì)，越來越被現(xiàn)代醫(yī)學(xué)所認(rèn)可。黃芪是臨床上常見的一味傳統(tǒng)中藥，藥理學(xué)研究表明，黃芪具有保護(hù)肝臟、利尿、增強(qiáng)機(jī)體免疫、降低血壓、降糖降脂、抗菌抗炎、抗氧化和抗腫瘤等作用。黃芪化學(xué)成分豐富，含黃芪多糖類、黃酮類、皂苷類、氨基酸、亞油酸、香草酸、硒、鐵、鋅等多種微量元素，其中黃芪總黃酮（Total flavonoids of Astragalus，TFA）是黃芪的主要活性成分，具有明顯的抗腫瘤、抗損傷、抗突變和抗炎等作用[9]。本實(shí)驗(yàn)室的研究已表明，TFA 具有一定的體內(nèi)抗炎免疫調(diào)節(jié)作用[10-11]，但其體外抗炎免疫作用及其機(jī)制還不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)以TFA 為研究對(duì)象，以正常培養(yǎng)和LPS 刺激的巨噬細(xì)胞RAW264.7 為體外模型，研究TFA 的體外抗炎免疫雙向調(diào)節(jié)作用及其作用機(jī)制，旨在為TFA 的臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)和抗炎免疫藥物的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料TFA（純度≥98%）購自南京澤朗公司；小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7 購自上海細(xì)胞庫；MTT、LPS 購自Sigma 公司；FBS、DMEM 購自Gibco 公司；細(xì)胞因子ELISA 檢測(cè)試劑盒購自Biovision 公司；TRIzol 試劑購自Invitrogen 公司；Prime-ScriptTMRT-PCR Kit 購自寶生物公司；漿蛋白、核蛋白提取試劑盒購自索萊寶公司；蛋白裂解液、BCA購自碧云天生物研究所；引物由Invitrogen 公司合成；鼠抗人IκBα、p-IκBα、IKKα/β、p-IKKα/β、C-NF-κB p65、N-NF-κB p65、β-Actin 等單克隆抗體（MAb）以及HRP 標(biāo)記的山羊抗鼠IgG 等均購自CST 公司。

1.2 TFA 安全劑量的篩選將RAW264.7 細(xì)胞接種于96 孔培養(yǎng)板，12 h 后分別加入0、10 μg/mL、20 μg/mL、 50 μg/mL、 100 μg/mL、 150 μg/mL、200 μg/mL TFA，每組設(shè)5 個(gè)復(fù)孔，37 ℃孵育24 h，按20 μL/孔加入MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，加入150 μL DMSO，振蕩10 min，測(cè)定各組細(xì)胞的OD570nm值，計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率=（試驗(yàn)組OD570nm值-調(diào)零組OD570nm值）/（對(duì)照組OD570nm值-調(diào)零組OD570nm值）。進(jìn)而篩選TFA 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞的安全劑量用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞因子IL-1β、IL-6 和TNF-α含量的測(cè)定分別按正常培養(yǎng)的RAW264.7 細(xì)胞和LPS 刺激的RAW264.7 細(xì)胞分組。正常培養(yǎng)條件下RAW264.7 細(xì)胞的藥物處理和分組：取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，分別加入10 μg/mL、25 μg/mL、100 μg/mL TFA 作用12 h 后分別取細(xì)胞上清液，同時(shí)設(shè)未加TFA 的細(xì)胞作為對(duì)照組；LPS 刺激的RAW264.7 細(xì)胞藥物處理和分組：取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，分別加入10 μg/mL、25 μg/mL、100 μg/mL TFA培養(yǎng)1 h后，分別加入終濃度為1 μg/mL的LPS 刺激，同時(shí)設(shè)1 μg/mL LPS 刺激的RAW264.7細(xì)胞作為LPS 刺激組，設(shè)未加TFA 的細(xì)胞為對(duì)照組。加入LPS 刺激12 h 后取細(xì)胞上清液，利用ELISA 試劑盒分別測(cè)定不同濃度的TFA 對(duì)正常培養(yǎng)和經(jīng)LPS 刺激的RAW264.7 細(xì)胞上清液中IL-1β、IL-6 和TNF-α 分泌水平。

1.4 細(xì)胞因子IL-1β、IL-6 和TNF-αmRNA 轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)按照1.3 進(jìn)行試驗(yàn)分組與給藥，12 h 后以TRIzol 法提取各組RAW264.7 細(xì)胞總RNA，測(cè)得RNA 純度與濃度后，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以其為模板，利用表1 中的引物，PCR 擴(kuò)增各組細(xì)胞中的細(xì)胞因子基因。PCR 產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳成像，經(jīng)Quantity one 軟件進(jìn)行條帶灰度分析，檢測(cè)不同濃度的TFA 對(duì)正常培養(yǎng)和LPS 刺激的RAW264.7 細(xì)胞中IL-1β、IL-6 和TNF-α 轉(zhuǎn)錄水平。

1.5 NF-κB 信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)的檢測(cè)按照1.3 試驗(yàn)分組與給藥，12 h 后經(jīng)RIPA 裂解液裂解各組細(xì)胞后，采用各蛋白提取試劑提取各組RAW264.7 細(xì)胞的總蛋白、漿蛋白和核蛋白，經(jīng)BCA法檢測(cè)各蛋白濃度后，分別以鼠抗人IKKα/β（1∶750）、p-IKKα/β（1∶1 000）、IκBα（1∶1 000）、p-IκBα（1∶1 000）、C-NF-κB p65（1∶1 000）、NNF-κB p65（1∶1 000）和β-actin（1∶1 000）MAb 為一抗，山羊抗鼠HRP-IgG（1∶1 000）為二抗，western blot 檢測(cè)各組RAW264.7 細(xì)胞NF-κB 信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白IKKα/β、p-IKKα/β、IκBα、p-IκBα、C-NF-κB p65 和N-NF-κB p65 的表達(dá)。

表1 擴(kuò)增各細(xì)胞因子的引物序列Table 1 Primer sequences of cytokines

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析各組數(shù)據(jù)，經(jīng)Dunnet’s t-test 檢驗(yàn)法進(jìn)行組間數(shù)據(jù)差異比較，多組比較采用方差分析，p＜0.05 表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 TFA 的安全劑量的篩選結(jié)果設(shè)7 個(gè)TFA 濃度分別作用RAW264.7 細(xì)胞24 h，經(jīng)MTT 法檢測(cè)細(xì)胞活力并根據(jù)公式計(jì)算各組細(xì)胞的存活率。計(jì)算結(jié)果顯示，7 個(gè)濃度TFA（0、10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、150 μg/mL、200 μg/mL）作用后的RAW 264.7 細(xì)胞的存活率分別是100%、102.03%、102.89%、101.15%、98.26%、91.01%和83.18%。0～150 μg/mL TFA 作用細(xì)胞的存活率與未加TFA 的空白對(duì)照組相比無顯著差異（p＞0.05）；200 μg/mL TFA 作用細(xì)胞的存活率與空白對(duì)照組相比差異顯著（p＜0.05）（圖1）。表明TFA在0～150 μg/mL對(duì)細(xì)胞無明顯毒性作用，所以本實(shí)驗(yàn)選用10 μg/mL、25 μg/mL、100 μg/mL濃度的TFA 進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 TFA 對(duì)正常培養(yǎng)的RAW264.7 細(xì)胞中IL-1β、IL-6和TNF-α含量影響的檢測(cè)結(jié)果以不同濃度TFA作用12 h 后取正常培養(yǎng)的RAW264.7 細(xì)胞上清液，采用相應(yīng)ELISA 試劑盒檢測(cè)各細(xì)胞因子的含量。結(jié)果顯示，與未加TFA 的對(duì)照組相比，10 μg/mL TFA 極顯著增加了細(xì)胞因子IL-1β、IL-6 及TNF-α 的分泌量（p＜0.01），25 μg/mL 和100 μg/mL TFA 也增加了細(xì)胞因子的分泌，但作用均不顯著（圖2）。表明TFA 可以刺激正常培養(yǎng)的RAW264.7 細(xì)胞中細(xì)胞因子IL-1β、IL-6 和TNF-α 的分泌，且以10 μg/mL 劑量為最優(yōu)。

2.3 TFA 對(duì)LPS 刺激的RAW264.7 細(xì)胞各細(xì)胞因子含量影響的檢測(cè)結(jié)果加入不同濃度TFA，再經(jīng)1 μg/mL LPS 刺激12 h 后取RAW264.7 細(xì)胞上清液，采用相應(yīng)ELISA 試劑盒檢測(cè)各細(xì)胞因子的含量。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，LPS 刺激急劇升高了IL-1β、IL-6 及TNF-α 的含量（p＜0.01），而25 μg/mL 和100 μg/mL TFA 顯著和極顯著降低了LPS 刺激引起的IL-1β 含量升高（p＜0.05；p＜0.01）；各劑量TFA 顯著和極顯著降低了LPS 刺激引起的IL-6 含量升高（p＜0.05；p＜0.01）；各劑量TFA 極顯著降低了LPS 刺激引起的TNF-α 含量升高（p＜0.01），且呈一定的劑量依賴關(guān)系（圖3）。表明各劑量TFA 均能夠明顯抑制LPS 刺激的RAW264.7 細(xì)胞過度釋放IL-1β、IL-6 及TNF-α。

圖1 不同濃度TFA 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞活性影響的檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Cytotoxicity of TFA at different concentrations on RAW264.7 cell

圖2 TFA 對(duì)正常培養(yǎng)的RAW264.7 細(xì)胞IL-1β、IL-6 和TNF-α 含量影響的檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Effects of TFA on the production of IL-1β,IL-6 and TNF-α in RAW264.7 cells

圖3 TFA 對(duì)LPS 刺激的RAW 264.7 細(xì)胞IL-1β、IL-6 和TNF-α 含量影響的檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Effects of TFA on the production of IL-1β,IL-6 and TNF-α in RAW 264.7 cells stimulated by LPS

2.4 TFA 對(duì)正常培養(yǎng)的RAW264.7 細(xì)胞各細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平影響的檢測(cè)結(jié)果通過RT-PCR 法檢測(cè)不同濃度TFA 作用的正常培養(yǎng)的RAW264.7 細(xì)胞各細(xì)胞因子mRNA 轉(zhuǎn)錄水平，并經(jīng)Quantity one 軟件進(jìn)行條帶灰度分析。結(jié)果顯示，與未加TFA 的對(duì)照組相比，25 μg/mL 和100 μg/mL TFA 顯著和極顯著提高了IL-1β mRNA 轉(zhuǎn)錄水平（p＜0.05；p＜0.01）；各劑量TFA 均極顯著提高了IL-6 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平（p＜0.01）；各劑量TFA 顯著和極顯著提高了TNF-α mRNA 轉(zhuǎn)錄水平（p＜0.05；p＜0.01）（圖4）。表明TFA 能夠促進(jìn)正常培養(yǎng)的RAW264.7 細(xì)胞中IL-1β、IL-6 及TNF-α mRNA 的轉(zhuǎn)錄水平，且呈一定的劑量依賴關(guān)系。

2.5 TFA 對(duì)LPS 刺激的RAW264.7 細(xì)胞各細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平影響的檢測(cè)結(jié)果通過RT-PCR 法檢測(cè)TFA 對(duì)LPS 刺激的RAW264.7 細(xì)胞各細(xì)胞因子mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，并經(jīng)Quantity one 軟件進(jìn)行條帶灰度分析。結(jié)果顯示，與空白組對(duì)照相比，LPS 刺激導(dǎo)致RAW264.7 細(xì)胞IL-1β、IL-6 及TNF-α mRNA 轉(zhuǎn)錄水平急劇增高（p＜0.01），而25 μg/mL和100 μg/mL TFA極顯著抑制了LPS 刺激的IL-1β mRNA 轉(zhuǎn)錄水平（p＜0.01）；各劑量TFA顯著和極顯著抑制了LPS刺激的IL-6 mRNA轉(zhuǎn) 錄 水 平（p＜0.05；p＜0.01）；25 μg/mL 和100 μg/mL TFA顯著和極顯著抑制了LPS刺激的TNF-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平（p＜0.05；p＜0.01）（圖5）。表明TFA 能夠抑制LPS 刺 激 的RAW264.7 細(xì) 胞IL-1β、IL-6 及TNF-α mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，且呈一定的劑量依賴關(guān)系。

圖5 TFA 對(duì)LPS 刺激的RAW264.7 細(xì)胞IL-1β、IL-6 和TNF-α mRNA 轉(zhuǎn)錄水平影響的檢測(cè)結(jié)果Fig.5 Effects of the mRNA levels of TFA on IL-1β,IL-6 and TNF-α in RAW264.7 cells stimulated by LPS

2.6 TFA 對(duì)正常培養(yǎng)的RAW264.7 細(xì)胞NF-κB 信號(hào)通路中相關(guān)蛋白表達(dá)影響的檢測(cè)結(jié)果通過western blot 檢測(cè)不同濃度TFA 作用的正常培養(yǎng)的RAW264.7細(xì)胞NF-κB 信號(hào)通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)變化，并經(jīng)Quantity One 軟件對(duì)目的蛋白條帶進(jìn)行光密度分析。結(jié)果顯示，與未加TFA 的對(duì)照組相比，25 μg/mL TFA 顯著下調(diào)正常培養(yǎng)的RAW264.7 細(xì)胞中IKKα/β、IκBα 蛋白的表達(dá)量（p＜0.05）、極顯著下調(diào)C-NF-κB p65 蛋白的表達(dá)量（p＜0.01），100 μg/mL TFA 均極顯著下 調(diào)IKKα/β、IκBα 和C-NF-κB p65 蛋 白 表 達(dá) 量（p＜0.01）；25 μg/mL TFA 極顯著上調(diào)p-IKKα/β 和NNF-κB p65 蛋白的表達(dá)量（p＜0.01）、顯著上調(diào)p-IκBα 蛋白的表達(dá)量（p＜0.05），100 μg/mL TFA 均極顯著上調(diào)p-IKKα/β、p-IκBα 和N-NF-κB p65 蛋白的表達(dá)量（p＜0.01）（圖6）。表明TFA 能夠抑制正常培養(yǎng)的RAW264.7 細(xì)胞NF-κB 信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白IKKα/β、IκBα及C-NF-κB p65的表達(dá)，促進(jìn)p-IKKα/β、p-IκBα和N-NF-κB p65蛋白的表達(dá)，從而適度活化NFκB信號(hào)通路而增強(qiáng)免疫，且呈一定的劑量依賴關(guān)系。

2.7 TFA 對(duì)LPS 刺激的RAW264.7 細(xì) 胞NF-κB 信號(hào)通路中相關(guān)蛋白表達(dá)影響的檢測(cè)結(jié)果通過western blot 檢 測(cè)TFA 對(duì)LPS 刺 激 的RAW264.7 細(xì) 胞NFκB 信號(hào)通路中相關(guān)蛋白表達(dá)的變化，并經(jīng)Quantity One 分析軟件對(duì)目的蛋白條帶進(jìn)行光密度分析。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，LPS 刺激導(dǎo)致RAW264.7 細(xì)胞中IKKα/β、IκBα、C-NF-κB p65 蛋白的表達(dá)量極顯著下調(diào)（p＜0.01），p-IKKα/β、p-IκBα 及N-NF-κB p65 蛋 白 的 表 達(dá) 量 極 顯 著 上 調(diào)（p＜0.01）。10 μg/mL TFA 顯 著 上 調(diào) 了LPS 所 致 的IKKα/β 蛋白表達(dá)量的下降（p＜0.05），25 μg/mL 和100 μg/mL TFA 極顯著上調(diào)了LPS 所致的IKKα/β 蛋白表達(dá)量的下降（p＜0.01），10 μg/mL和25 μg/mL TFA顯著上調(diào)了LPS 所致的IκBα 蛋白表達(dá)量的下降（p＜0.05），100 μg/mL TFA 極顯著上調(diào)了LPS 所致的IκBα蛋白表達(dá)量的下降（p＜0.01），各劑量TFA均極顯著上調(diào)C-NF-κB p65 蛋白的表達(dá)量（p＜0.01）；25 μg/mL TFA顯著抑制了LPS所致的p-IKKα/β蛋白的過度表達(dá)（p＜0.05），100 μg/mL TFA 極顯著抑制了LPS所致的p-IKKα/β 蛋白的過度表達(dá)（p＜0.01），10 μg/mL TFA顯著抑制了LPS所致的p-IκBα和N-NF-κB p65蛋白的過度表達(dá)（p＜0.05），25 μg/mL 和100 μg/mL TFA 均極顯著抑制了LPS 所致的p-IκBα 和N-NF-κB p65 蛋白的過度表達(dá)（p＜0.01）（圖7）。表 明TFA 能 夠 促 進(jìn)LPS 刺 激 的RAW264.7 細(xì)胞NF-κB 信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白IKKα/β、IκBα、C-NF-κB p65 的表達(dá)，抑制p-IKKα/β、p-IκBα 及N-NF-κB p65 蛋白的過度表達(dá)，從而抑制NF-κB 信號(hào)通路的過度激活而起到抗炎作用，且呈一定的劑量依賴關(guān)系。

圖6 TFA 對(duì)正常培養(yǎng)的RAW264.7 細(xì)胞NF-κB 信號(hào)通路中相關(guān)蛋白表達(dá)影響的檢測(cè)結(jié)果Fig.6 Effects of TFA on the expression levels of the NF-κB signaling pathway related proteins in RAW264.7 cells

圖7 TFA 對(duì)LPS 刺激的RAW264.7 細(xì)胞NF-κB 信號(hào)通路中相關(guān)蛋白表達(dá)影響的檢測(cè)結(jié)果Fig.7 Effects of TFA on the expression levels of the NF-κB signaling pathway related proteins in RAW264.7 cells stimulated by LPS

3 討 論

細(xì)胞因子是細(xì)胞間信息傳遞的信使，是反映機(jī)體免疫應(yīng)答與炎癥調(diào)控的重要指標(biāo)。細(xì)胞因子具有雙重性：當(dāng)機(jī)體正常時(shí)，適量釋放的細(xì)胞因子相互調(diào)控，激活免疫系統(tǒng)，進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能；當(dāng)機(jī)體受應(yīng)激時(shí)，機(jī)體通過調(diào)控細(xì)胞因子及時(shí)參與炎癥反應(yīng)，常伴隨有細(xì)胞因子表達(dá)的異常。TNFα、IL-6 和IL-1β 作為主要細(xì)胞因子，在機(jī)體免疫應(yīng)答和炎癥調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。TNF-α 是一類在炎癥調(diào)控中占據(jù)主導(dǎo)地位的雙重活性細(xì)胞因子，機(jī)體正常時(shí)適量分泌的TNF-α 能夠介導(dǎo)免疫應(yīng)答，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞殺傷活性等進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體免疫機(jī)能，但大量釋放的TNF-α 能夠誘導(dǎo)其他炎性介質(zhì)、氧自由基的分泌，加劇炎癥的發(fā)展[12]。IL-1β 是IL-1 家族中最為重要的前炎性因子，適量釋放可以提高機(jī)體免疫應(yīng)答，也能協(xié)同IL-6 等炎性因子釋放大量級(jí)聯(lián)炎性因子或介質(zhì)，加劇炎癥過程[13-14]。體內(nèi)研究結(jié)果顯示，TFA 能夠升高免疫功能低下的小鼠血清中細(xì)胞因子水平，從而增強(qiáng)小鼠的免疫功能[15]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究也表明，TFA通過抑制佐劑誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎大鼠血清中IL-1β、TNF-α 等炎性因子的過度釋放，對(duì)大鼠關(guān)節(jié)炎修復(fù)起到免疫調(diào)節(jié)作用[16]。本實(shí)驗(yàn)從抗炎與免疫應(yīng)答兩方面經(jīng)體外研究TFA對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7 的細(xì)胞因子分泌的影響。結(jié)果顯示，TFA能夠促進(jìn)正常培養(yǎng)的RAW264.7 細(xì)胞中細(xì)胞因子的含量及mRNA 轉(zhuǎn)錄水平，具有一定的免疫增強(qiáng)作用；其能夠抑制LPS 刺激的RAW264.7 細(xì)胞細(xì)胞因子的含量及其mRNA 水平的過度轉(zhuǎn)錄，體現(xiàn)出明顯的抗炎效果，表明TFA 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞細(xì)胞因子具有抗炎免疫雙向調(diào)節(jié)作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與以前研究報(bào)道的體內(nèi)研究結(jié)果相一致[13-14]。

Toll 樣受體是機(jī)體免疫應(yīng)答中關(guān)鍵的識(shí)別性受體，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)其有15 種成員，其中Toll 樣受體4（TLR4）是LPS 激活免疫應(yīng)答所必需的特異性免疫受體，主要存在于巨噬細(xì)胞、T 和B 淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等細(xì)胞表面[17]。LPS 與TLR4 受體結(jié)合通過髓樣分化因子Myd88 途徑激活NF-κB 信號(hào)通路是誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)的重要環(huán)節(jié)[18-19]。NF-κB 是機(jī)體關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，能夠參與調(diào)控免疫應(yīng)答與炎癥反應(yīng)。NF-κB 信號(hào)通路受到諸多級(jí)聯(lián)因子的調(diào)控，主要由NF-κB 抑制蛋白IκB、IκB 激酶IKKα/β 等級(jí)聯(lián)反應(yīng)調(diào)節(jié)各通路蛋白及其磷酸化活性，從而調(diào)控NF-κB 信號(hào)通路的活化。當(dāng)細(xì)胞受到刺激后，IκBα 在IκBα 激酶作用下被快速磷酸化，隨后NF-κB 被釋放轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，激活NF-κB 靶位點(diǎn)基因，誘導(dǎo)炎癥相關(guān)基因表達(dá)[20-23]。最近研究顯示，TFA 抑制骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞炎癥因子的分泌機(jī)制與其下調(diào)NF-κB 信號(hào)通路有關(guān)[24]。為了進(jìn)一步探究TFA 抗炎免疫應(yīng)答的雙向調(diào)節(jié)作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)研究了TFA 對(duì)正常培養(yǎng)與LPS 刺激的RAW264.7 細(xì)胞NF-κB 通路中關(guān)鍵蛋白影響，結(jié)果表明TFA 可以調(diào)節(jié)正常和LPS 刺激的RAW264.7 細(xì)胞中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，適度活化正常情況下細(xì)胞中NF-κB 信號(hào)通路和抑制LPS 刺激后的細(xì)胞中NF-κB 信號(hào)通路的過度激活，從而調(diào)控細(xì)胞因子的分泌和表達(dá)?？傊緦?shí)驗(yàn)以正常條件下和LPS 誘導(dǎo)條件下的小鼠RAW264.7細(xì)胞作為體外模型，模擬機(jī)體在“正?！迸c“異?！钡那樾蜗拢琓FA 對(duì)免疫細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的調(diào)控作用及調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，TFA 通過調(diào)節(jié)正常和LPS 刺激的RAW264.7 細(xì)胞NF-κB 通路中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，適度活化NF-κB 信號(hào)通路和抑制NF-κB 信號(hào)通路的過度激活，提高正常狀態(tài)下細(xì)胞因子含量及mRNA 轉(zhuǎn)錄水平，抑制LPS 刺激下促炎因子的過度釋放及mRNA 水平的過度轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮其抗炎免疫雙向調(diào)節(jié)作用。本研究為TFA 的臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)和相關(guān)抗炎免疫藥物的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。