五味子多糖對(duì)NAFLD大鼠肝臟SREBP2/HMGCR表達(dá)的影響

吳金瀅，王春梅

(1.吉林醫(yī)藥學(xué)院，吉林 吉林 132013；2.北華大學(xué)，吉林 吉林 132013)

非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是臨床上常見的一種代謝應(yīng)激性肝臟損傷，主要是由遺傳易感、過度肥胖、Ⅱ型糖尿病、高脂血癥等相關(guān)因素而造成，嚴(yán)重者可導(dǎo)致肝臟纖維化、肝癌等，危害人類的健康[1]。近年來，由于生活條件及飲食結(jié)構(gòu)的改變，使得該病患病率不斷升高，已經(jīng)影響全球人口的1/3[2]。NAFLD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前除了控制飲食、適當(dāng)運(yùn)動(dòng)，還沒有有效的治療手段。有研究表明脂質(zhì)代謝紊亂是導(dǎo)致NAFLD發(fā)生發(fā)展的重要因素，而固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(sterol regulatory element-binding proteins，SREBPs)是肝臟脂代謝的關(guān)鍵調(diào)控因子，其表達(dá)上調(diào)，可導(dǎo)致甘油三酯和膽固醇代謝紊亂，促進(jìn)NAFLD的發(fā)展，被認(rèn)為是防治NAFLD的關(guān)鍵靶點(diǎn)[3]。

五味子是吉林省道地藥材，被古代醫(yī)家奉為上品，具有多種藥理功效[4]。研究表明，北五味子粗多糖(Schisandrachinensispolysaccharide,SCP)對(duì)酒精和四氯化碳所致小鼠急性化學(xué)性肝損傷具有明顯的保護(hù)作用[5-6]，對(duì)高脂飲食聯(lián)合小劑量鏈脲佐菌素誘導(dǎo)2型糖尿病大鼠肝臟也起到保護(hù)作用，且具有顯著的調(diào)節(jié)血脂作用[7-8],因此推測(cè)SCP對(duì)NAFLD具有防治作用。本研究在前期工作基礎(chǔ)上，建立高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠NAFLD模型，以肝臟膽固醇代謝紊亂為切入點(diǎn)，探討SCP防治NAFLD的作用及其機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼料:雄性SPF級(jí)SD大鼠,長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，合格證號(hào)：SCXK(吉)2018—0007，體重160～180 g。實(shí)驗(yàn)大鼠分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)室(清潔級(jí))溫度18～23 ℃，濕度40%～60%，明暗交替，每日喂食，自主飲水。實(shí)驗(yàn)大鼠的普通飼料及高脂飼料均由長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司提供。其中高脂飼料含有豬油(15%)、蔗糖(20%)、膽固醇(1.2%)、膽酸鈉(0.2%)、酪蛋白(10%)、磷酸氫鈣(0.6%)、基礎(chǔ)飼料(53%)。

實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備:ESJ110-4B電子分析天平(沈陽龍騰電子有限公司)，Centrifuge 5424R離心機(jī)(德國(guó)艾本德儀器制造有限公司)，AX-ⅡX射線攝影暗匣(廣東奧華醫(yī)療器械廠有限公司)，全自動(dòng)酶標(biāo)儀(瑞士TECAN公司)，電泳儀(美國(guó)Bio-Rad)，RT-PCR系統(tǒng)(德國(guó)Biometra ABI 7500)。

實(shí)驗(yàn)藥品和試劑:SCP(吉林醫(yī)藥學(xué)院藥物分析實(shí)驗(yàn)室制，用蒸餾水配制成所需要的濃度后，使用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)進(jìn)行乳化，功率為400 W，間隙3 s/次，時(shí)間為15 min，混勻后于4 ℃冰箱保存待用)，SREBP-2抗體和HMGCR抗體(武漢Abclonal)，引物(北京鼎國(guó))，BCA蛋白測(cè)定試劑盒、RIPA裂解液(強(qiáng))、PMSF、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5X)(碧云天生物技術(shù)研究所)。

1.2 NAFLD大鼠模型的建立、分組及給藥

將40只大鼠隨機(jī)分成4組，每組10只，分別為正常對(duì)照組(CON)、正常+SCP給藥組(CON+SCP 100 mg/kg)、NAFLD模型組(NAFLD)、NAFLD模型+SCP治療組(NAFLD+SCP 100 mg/kg)。CON、CON+SCP組以普通飼料喂養(yǎng)，NAFLD、NAFLD+SCP組以高脂飲食喂養(yǎng)。4周后，禁食12 h，眼球取血，檢測(cè)大鼠血清中總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)及高密度脂蛋白(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)的含量，確定大鼠出現(xiàn)高脂血癥。造模成功的高脂血癥大鼠采用灌胃方式進(jìn)行給藥，CON組及NAFLD組給予等體積溶媒；正常+SCP組及模型+SCP組給予SCP 100 mg/kg。全部大鼠均每日灌胃一次，灌胃8周，并每周測(cè)量每只大鼠體重。

1.3 血清生化指標(biāo)檢測(cè)

治療結(jié)束后，所有大鼠禁食12 h，乙醚麻醉，腹主動(dòng)脈取血，3500 r/min離心10 min，收集上層血清，按照試劑盒說明書檢測(cè)TC、TG、LDL-C和HDL-C。

1.4 RT-PCR檢測(cè)

用Trizol試劑(Invitrogen，美國(guó))從大鼠肝組織中提取總RNA，并按照HiScriptRⅡ一步qRT-PCR試劑盒(鼎國(guó)，北京)的操作方法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄進(jìn)行，最終體積為20 μL。PCR引物序列使用primer 6.0軟件設(shè)計(jì)，并由鼎國(guó)長(zhǎng)生生物科技有限公司(北京)合成?；虮磉_(dá)水平使用SYBR qPCR試劑盒(鼎國(guó)，北京)在RT-PCR系統(tǒng)(ABI 7500，Biometra，德國(guó))上進(jìn)行分析。根據(jù)Ct值，計(jì)算2-ΔΔCt，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 Western blot檢測(cè)

BCA法測(cè)定大鼠肝組織總蛋白濃度，電泳分離目標(biāo)蛋白，轉(zhuǎn)膜，隨后用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液封閉1 h。加入Ⅰ抗(SREBP-2和HMGCR，1∶2000稀釋)4 ℃過夜。TBST緩沖液洗滌3次后室溫孵育Ⅱ抗1 h，ECL顯影，拍照并分析結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 SCP對(duì)NAFLD大鼠血脂的影響

結(jié)果如表1所示，模型組大鼠血清中TC、TG、LDL-C水平顯著高于正常對(duì)照組，HDL-C的水平顯著降低(P<0.01)，說明高脂飲食誘導(dǎo)的高脂血癥模型成功。而與模型組比較，SCP多糖治療8周顯著降低了NAFLD大鼠血清中TC、TG、LDL-C水平，提高了HDL-C水平，提示SCP對(duì)NAFLD大鼠的脂代謝紊亂具有一定的調(diào)節(jié)作用。

表 1 SCP對(duì)NAFLD大鼠血脂的影響(±s,n=10，mmol/L)

表 1 SCP對(duì)NAFLD大鼠血脂的影響(±s,n=10，mmol/L)

組別TCTGLDL-CHDL-CCON3.26±0.210.92±0.150.98±0.061.79±0.31CON+SCP3.07±0.250.89±0.140.95±0.121.75±0.32NAFLD5.98±0.65**1.58±0.29**2.34±0.32**1.14±0.17**NAFLD+SCP4.48±0.77#1.21±0.18#1.28±0.25#1.48±0.29#

與CON組和CON+SCP組比較**P<0.01；與NAFLD模型組比較#P<0.05

2.2 SCP對(duì)NAFLD大鼠肝臟SREBP-2/HMGCR基因表達(dá)的影響

與正常組對(duì)照相比，NAFLD模型組大鼠肝臟膽固醇代謝調(diào)節(jié)關(guān)鍵蛋白SREBP-2和HMGCR mRNA表達(dá)水平均明顯升高(P<0.01)。與NAFLD模型組比較，SCP治療顯著下調(diào)了SREBP-2和HMGCR的MRNA表達(dá)(P<0.05)。結(jié)果見圖1。

與正常組比較**P<0.01；與NAFLD模型組比較#P<0.05

2.3 SCP對(duì)NAFLD大鼠肝臟SREBP-2/HMGCR蛋白表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組比較，NAFLD模型組大鼠肝臟膽固醇代謝調(diào)節(jié)關(guān)鍵蛋白SREBP-2和HMGCR蛋白表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05)。與NAFLD模型組比較，SCP治療后顯著降低了SREBP-2和HMGCR蛋白的表達(dá)水平(P<0.05)。結(jié)果見圖2。

與正常組比較**P<0.01；與NAFLD模型組比較#P<0.05

3 討 論

NAFDL是以肝臟細(xì)胞脂肪變性和脂肪沉積為病理特征的慢性肝病，其發(fā)病率在國(guó)內(nèi)外呈明顯上升趨勢(shì)。目前臨床尚缺乏有效的治療藥物。近年來，中醫(yī)藥在調(diào)節(jié)機(jī)體脂代謝紊亂方面的應(yīng)用越來越受到重視。五味子是傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中著名的保肝降酶藥物，對(duì)化學(xué)性肝損傷、病毒性肝損傷等均具有良好的效果。本研究進(jìn)一步證實(shí)SCP可降低高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD大鼠的血脂水平，改善其脂代謝紊亂，緩解脂肪性肝病的進(jìn)程。

眾多研究表明，脂質(zhì)代謝紊亂能夠?qū)е赂闻K細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)嚴(yán)重蓄積，從而形成NAFLD。SREBPs是一類位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的膜連接蛋白，具有核轉(zhuǎn)錄因子活性，參與調(diào)控膽固醇、甘油三酯和脂肪酸的生物合成關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。其中SREBP-2是SREBPs典型的一種表達(dá)形式，主要參與介導(dǎo)膽固醇生物合成的反饋調(diào)節(jié)。HMGCR屬于SREBP-2下游重要調(diào)控因子，是膽固醇合成的限速酶[9]。SREBP-2的異常表達(dá)可引起游離膽固醇、脂肪酸代謝紊亂，成為了導(dǎo)致NAFLD發(fā)病的重要因素。本研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)大鼠經(jīng)高脂飲食喂養(yǎng)后，NAFLD模型大鼠肝臟組織中SREBP-2和HMGCR基因和蛋白表達(dá)水平均明顯升高，而通過SCP治療后的大鼠肝臟組織中SREBP-2和HMGCR基因和蛋白表達(dá)水平均明顯降低，從而減少膽固醇的內(nèi)源性合成，達(dá)到對(duì)細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平的有效調(diào)控。

綜上所述,本研究證實(shí)了SCP能夠調(diào)節(jié)NAFLD大鼠的血脂紊亂,其作用機(jī)制可能與下調(diào)肝臟膽固醇代謝關(guān)鍵因子SREBP-2/HMGCR表達(dá)有關(guān)。