(河南醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校藥學(xué)系化學(xué)教研室,鄭州 451191)

氨基葡萄糖是人體軟骨中糖胺聚糖和透明質(zhì)酸的主要成分,能夠促進軟骨基質(zhì)的重建,延緩骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病進程。硫酸軟骨素是關(guān)節(jié)軟骨的基本組成物質(zhì),有助于促進骨鈣沉積、幫助新骨形成,硫酸軟骨素與氨基葡萄糖結(jié)合使用能有效地保護及修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨[1]。隨著人們生活水平的提高,公眾的健康意識和健康需求也不斷增強,氨基葡萄糖和硫酸軟骨素添加類保健食品也越來越受到中老年人的青睞。氨基葡萄糖和硫酸軟骨素預(yù)防與修復(fù)關(guān)節(jié)炎的藥效與其含量相關(guān),含量不達標(biāo)時會影響其保健效果[2]。因此,在氨基葡萄糖和硫酸軟骨素添加類保健食品的研制與生產(chǎn)過程中,需嚴(yán)格保證氨基葡萄糖和硫酸軟骨素的添加量。

文獻[3]采用分光光度法測定了氨基葡萄糖與硫酸軟骨素含量。文獻[4]采用分光光度法測定復(fù)方硫酸軟骨素片中硫酸軟骨素含量。與化學(xué)分析法相比,高效液相色譜法更為靈敏、快速、準(zhǔn)確。文獻[5]采用C18色譜柱和紫外檢測器,建立了測定硫酸軟骨素和氨基葡萄糖含量的高效液相色譜法,目標(biāo)物保留時間約為2 min,不利于復(fù)雜樣品的分析。文獻[6]采用C18色譜柱,蒸發(fā)光散射檢測器,高效液相色譜法測定了硫酸軟骨素。文獻[7]使用強陰離子交換硅膠柱,采用高效液相色譜法測定復(fù)方鹽酸氨基葡萄糖硫酸軟骨素片中硫酸軟骨素的含量?，F(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 20365－2006《硫酸軟骨素和鹽酸氨基葡萄糖含量的測定液相色譜法》采用C18色譜柱測定氨基葡萄糖與硫酸軟骨素。氨基葡萄糖與硫酸軟骨素在烷基色譜柱上不易保留,出峰時間在2 min左右,接近于死時間,易產(chǎn)生與雜質(zhì)共流出的現(xiàn)象;氨基葡萄糖與硫酸軟骨素在C18色譜柱上的分離度小于1.5,這影響定量結(jié)果的準(zhǔn)確性;所選擇的192 nm 紫外檢測波長不具有特異性,樣品中雜質(zhì)組分和流動相在該檢測波長處易產(chǎn)生紫外吸收,造成紫外檢測器的基線升高,過高的噪聲信號影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。色譜柱和檢測器的選擇對于提高液相色譜法的靈敏度、選擇性及分析結(jié)果的準(zhǔn)確性具有重要的意義[8]。本工作分別采用C18色譜柱和紫外檢測器,氨基色譜柱和蒸發(fā)光散射檢測器,建立了2種高效液相色譜法測定保健食品中氨基葡萄糖與硫酸軟骨素,系統(tǒng)化研究了色譜柱和檢測器對高效液相色譜法(HPLC)測定保健食品中氨基葡萄糖和硫酸軟骨素的影響。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Alliance 2695型高效液相色譜儀,配蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)和紫外檢測器(UV);Solaris XE型氮氣發(fā)生器;CT15RE型高速離心機。

氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:5.00 g·L－1,稱取0.500 g的氨基葡萄糖于100 mL 容量瓶中,用流動相定容,于4 ℃冰箱保存。

硫酸軟骨素標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:3.00 g·L－1,稱取0.300 g的硫酸軟骨素于100 mL 容量瓶中,用流動相定容,于4 ℃冰箱保存。

D-(＋)-氨基葡萄糖鹽酸鹽的純度不小于99%;硫酸軟骨素標(biāo)準(zhǔn)品的純度不小于99%;庚烷磺酸鈉的純度大于98.0%;乙腈為色譜純;其余試劑均為分析純;試驗用水為超純水,符合國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 6682－2008)的要求。

1.2 儀器工作條件

1)色譜條件(氨基色譜柱和蒸發(fā)光散射檢測器) NH2P-50-4E氨基色譜柱(4.6 mm×250 mm,5μm),柱溫40 ℃;流動相為0.1%(體積分?jǐn)?shù))三氟乙酸溶液與乙腈以體積比95∶5組成的混合液;氮氣壓力3.10×105Pa;加熱器級別75%;漂移管溫度70 ℃;蒸發(fā)光散射檢測器的增益值80;進樣體積10μL;流量1.0 mL·min－1。

2)色譜條件(C18色譜柱和紫外檢測器) Symmetry C18烷基色譜柱(4.6 mm×250 mm,5μm),柱溫30 ℃;流動相為10 mmol·L－1庚烷磺酸鈉溶液與乙腈以體積比95∶5組成的混合液;檢測波長195 nm;進樣體積10μL;流量1.0 mL·min－1。

1.3 試驗方法

保健食品樣品研磨并混勻后稱取100 mg置于錐形瓶中,加10 mL 乙腈和10 mL 水,振蕩混合后超聲提取20 min,以6 000 r·min－1轉(zhuǎn)速離心,取上清液。按照上述程序重復(fù)超聲提取3次,上清液合并后轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中,用流動相定容后混合均勻,經(jīng)0.45μm 濾膜凈化后按儀器工作條件進行測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 HPLC-ELSD的建立

按色譜條件(氨基色譜柱和蒸發(fā)光散射檢測器)對氨基葡萄糖和硫酸軟骨素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進行測定,其色譜圖見圖1。

圖1 氨基葡萄糖和硫酸軟骨素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖(蒸發(fā)光散射檢測器)Fig.1 Chromatogram of mixed standard solution of glucosamine and chondroitin sulfate(ELSD)

由圖1可知:氨基葡萄糖和硫酸軟骨素的色譜峰呈正態(tài)分布,氨基葡萄糖和硫酸軟骨素在該色譜體系的分離度大于1.5,氨基葡萄糖和硫酸軟骨素的色譜峰相互之間沒有干擾。

按試驗方法(HPLC-ELSD)對保健食品樣品進行分析,其色譜圖見圖2。

圖2 保健食品樣品的色譜圖(蒸發(fā)光散射檢測器)Fig.2 Chromatogram of the sample of health food(ELSD)

由圖2可知:在10 min內(nèi),保健食品樣品中的氨基葡萄糖和硫酸軟骨素與雜質(zhì)得到了基線分離,保健食品樣品中硫酸軟骨素和氨基葡萄糖的出峰時間與混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中硫酸軟骨素和氨基葡萄糖的出峰時間基本一致(相對偏差＜1.0%)。

2.2 HPLC-UV的建立

按色譜條件(C18色譜柱和紫外檢測器)對氨基葡萄糖和硫酸軟骨素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進行測定,其色譜圖見圖3。

由圖3可知:氨基葡萄糖和硫酸軟骨素的保留時間分別為2.27,1.83 min,氨基葡萄糖和硫酸軟骨素的分離度小于1.5。

圖3 氨基葡萄糖和硫酸軟骨素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖(紫外檢測器)Fig.3 Chromatogram of mixed standard solution of glucosamine and chondroitin sulfate(UV)

氨基葡萄糖和硫酸軟骨素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的紫外光譜見圖4。

由圖4可知:隨著檢測波長的增加,氨基葡萄糖和硫酸軟骨素的紫外吸收逐漸降低。試驗選擇檢測波長為195 nm。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

分別移取適量的5.00 g·L－1氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液和3.00 g·L－1硫酸軟骨素標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液于100 mL容量瓶中,用流動相定容,得到混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液系列中氨基葡萄糖的質(zhì)量濃度依次為20.0,40.0,80.0,150.0,300.0 mg·L－1,硫酸軟骨素的質(zhì)量濃度依次為50.0,100.0,200.0,300.0,500.0 mg·L－1。按儀器工作條件對上述氨基葡萄糖和硫酸軟骨素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進行測定。

圖4 氨基葡萄糖和硫酸軟骨素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的紫外光譜Fig.4 UV spectra of mixed standard solution of glucosamine and chondroitin sulfate

HPLC-ELSD 采用液相色譜工作站處理軟件Ln～Ln雙對數(shù)方程擬合氨基葡萄糖和硫酸軟骨素的質(zhì)量濃度和色譜峰面積,擬合時要求相關(guān)系數(shù)的平方大于0.995 0,得到氨基葡萄糖和硫酸軟骨素的線性范圍并生成標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù),結(jié)果見表1。在線性范圍內(nèi),蒸發(fā)光散射檢測器響應(yīng)值的自然對數(shù)與氨基葡萄糖和硫酸軟骨素質(zhì)量濃度的常用對數(shù)呈線性關(guān)系。線性回歸方程中,x是質(zhì)量濃度的自然對數(shù),y是色譜峰面積的自然對數(shù)。

HPLC-UV 以氨基葡萄糖和硫酸軟骨素的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),對應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。氨基葡萄糖和硫酸軟骨素的線性范圍、線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表1。根據(jù)3倍信噪比計算方法的檢出限(3S/N),結(jié)果見表1。

表1 線性范圍、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限Tab.1 Linearity ranges,linear regression equations,correlation coefficients and detection limits

2.4 方法的精密度

在空白保健食品樣品中加入100.0 mg·L－1氨基葡萄糖和硫酸軟骨素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按試驗方法進行分析,平行測定7次,計算測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表2。

由表2可知:RSD 小于1.5%。

2.5 兩種色譜方法的對比

氨基葡萄糖和硫酸軟骨素的極性較強,現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)中采用反相C18柱色譜法,極性較大的化合物在弱極性的烷基柱中幾乎不保留,目標(biāo)峰出現(xiàn)在2 min左右,保留時間接近于色譜柱死時間。文獻[9-10]也注意到氨基葡萄糖在烷基柱上的弱保留的問題,過短的保留時間會導(dǎo)致待測組分和樣品雜質(zhì)發(fā)生共流出現(xiàn)象,待測組分峰受到溶劑峰及雜質(zhì)峰的干擾,影響測定結(jié)果的可靠性與準(zhǔn)確性。試驗采用中等極性的氨基色譜柱,調(diào)整有機相與水相的比例,可以控制氨基葡萄糖和硫酸軟骨素在色譜柱上的保留時間,避免了色譜保留時間過短所引起的雜質(zhì)共流出的問題。在樣品分析過程中通過調(diào)整流動相比例,使氨基葡萄糖和硫酸軟骨素達到完全分離(分離度大于1.5)。

表2 精密度試驗結(jié)果(n＝7)Tab.2 Results of test for precision(n＝7)

氨基葡萄糖和硫酸軟骨素沒有強的發(fā)光基團和特征紫外-可見吸收波長,紫外光吸收強度低,液相色譜法常選擇近紫外區(qū)190 nm 為檢測波長。受溶劑截止波長的限制,190 nm 紫外波長會引起嚴(yán)重的基線漂移,同時雜質(zhì)組分在近紫外區(qū)易產(chǎn)生紫外光吸收,降低了測定結(jié)果的重現(xiàn)性。與紫外檢測器不同,蒸發(fā)光散射檢測器是通用型檢測器,樣品中的基質(zhì)和流動相溶劑對檢測信號幾乎無噪聲干擾。對于存在干擾基質(zhì)的保健食品,蒸發(fā)光散射檢測器比紫外檢測器的抗干擾能力更強,定量結(jié)果更為準(zhǔn)確可靠。

將2種高效液相色譜法應(yīng)用于保健食品中氨基葡萄糖和硫酸軟骨素的測定,并按試驗方法對上述樣品進行加標(biāo)回收試驗,樣品分析結(jié)果見表3。

表3 樣品分析結(jié)果(n＝7)Tab.3 Analytical results of the samples(n＝7)

由表3可知:HPLC-ELSD 的測定結(jié)果較為準(zhǔn)確,而HPLC-UV 由于保留時間過短,無法排除雜質(zhì)的干擾,測定結(jié)果和已知值出現(xiàn)較大的偏差;在有干擾雜質(zhì)存在下,HPLC-ELSD 的回收率比HPLCUV 的回收率高?；厥章屎蚏SD 的測定結(jié)果表明:在分析復(fù)雜樣品時HPLC-ELSD 的精密度和準(zhǔn)確度更為可靠。

本工作研究了C18色譜柱和氨基色譜柱,紫外檢測器和蒸發(fā)光散射檢測器對高效液相色譜法測定保健食品中氨基葡萄糖和硫酸軟骨素的影響。保健食品中氨基葡萄糖和硫酸軟骨素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)一般在10%以上,若保健食品的基質(zhì)比較簡單,則兩種方法均可以快速、準(zhǔn)確地測定氨基葡萄糖和硫酸軟骨素的含量。與采用C18色譜柱和紫外檢測器的高效液相色譜法相比,采用氨基色譜柱和蒸發(fā)光散射檢測器建立的高效液相色譜法對保健食品中氨基葡萄糖和硫酸軟骨素的分離度更好,測定靈敏度、重現(xiàn)性和準(zhǔn)確度更高,適用于復(fù)雜樣品中氨基葡萄糖和硫酸軟骨素的同時測定。