吡西達(dá)替尼抑制NLRP3通路保護(hù)腦缺血后神經(jīng)功能的恢復(fù)

杜小雪 鄒陽(yáng) 方馬榮

缺血性腦卒中（cerebral ischemic stroke）是臨床上常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，可引起腦內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞免疫應(yīng)答和急劇的炎癥反應(yīng)。小膠質(zhì)細(xì)胞是卒中后炎癥反應(yīng)最主要的細(xì)胞來(lái)源。NLRP3 是NOD 樣炎癥小體，在腦內(nèi)參與調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞集落因子1 受體（CSF1R）介導(dǎo)的下游炎癥反應(yīng)，并催化促炎因子釋放，加重神經(jīng)損傷［1］。因此尋找抑制NLRP3 的抗炎藥物對(duì)緩解腦缺血患者體內(nèi)炎癥和神經(jīng)損傷具有重要作用。吡西達(dá)替尼（Pexidartinib）是一種新型口服小分子酪氨酸激酶抑制劑，對(duì)CSF1R 具有較強(qiáng)的選擇抑制性。被報(bào)道作為臨床抗癌前期實(shí)驗(yàn)藥物用于腱鞘巨細(xì)胞腫瘤的Ⅰ期、Ⅲ期治療等［2］。本研究主要從NLRP3 信號(hào)通路探究吡西達(dá)替尼對(duì)腦缺血小鼠抗炎機(jī)制的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 雄性C57/B6J 小鼠50 只，體質(zhì)量25～30g，清潔級(jí)，8 周齡。所有小鼠購(gòu)自中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心/上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，小鼠的飼養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)操作均于浙江大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心完成。

1.2 藥物 實(shí)驗(yàn)用藥品吡西達(dá)替尼Pexidartinib，又稱PLX-3397，購(gòu)自MCE 公司，目錄號(hào)為HY-16749，并溶解于DMSO 溶液中至10mg/ml 備用。

1.3 試劑和儀器 抗Iba1 抗體購(gòu)自Abcam 公司（兔抗，批號(hào)ab178847）；抗NLRP3 抗體購(gòu)自Abcam 公司（兔抗，批號(hào)ab214185）；抗Caspase1 抗體購(gòu)自Abcam公司（兔抗，批號(hào)ab179515）；抗NF-κB 抗體購(gòu)自Abcam 公司（兔抗，批號(hào)ab16502）；超敏酶標(biāo)羊抗兔抗體來(lái)自于北京中杉生物公司（批號(hào)107257D9）；熒光羊抗兔抗體來(lái)自武漢博士德公司（批號(hào)BA1142）；RNA 提取試劑盒購(gòu)自TaKaRa 公司（批號(hào)AK1401）；SYBR PremixEx TaqTMII 購(gòu) 自TaKaRa 公 司（ 批 號(hào)AKA1201）；PrimeScriptTMRT Master Mix 購(gòu) 自TaKaRa公司（批號(hào)AK5101）。冰凍切片機(jī)來(lái)自德國(guó)LAIKA 公司；Olympus BX53 手動(dòng)正置熒光顯微鏡來(lái)自O(shè)lympus公司；Bio-Rad 化學(xué)發(fā)光成像儀來(lái)自杭州寶誠(chéng)生物技術(shù)有限公司；吸入麻醉機(jī)來(lái)自深圳瑞沃德公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法 （1）動(dòng)物分組。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組，將大鼠隨機(jī)分為5 組，每組各10 只：①正常組；②假手術(shù)組；③DMSO 組；④腦缺血組；⑤吡西達(dá)替尼組。（2）造模。小鼠局灶性腦缺血-再灌注損傷模型參照Coll 等［3］的方法建立。具體操作過(guò)程如下：小鼠稱重，腹腔注射5%戊巴比妥鈉（5ml/kg）麻醉。仰臥固定后，頸部正中縱切口，分離并暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA），頸外動(dòng)脈（ECA）和頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA）。結(jié)扎CCA 近心端和ECA 基底部，CCA 處剪口，用直徑為0.3mm 的線栓插入右CCA 管腔，并緩慢前進(jìn)至ICA 遠(yuǎn)端直至不能推進(jìn)為止，約7mm。缺血90min 后緩慢將線栓拉出并結(jié)扎CCA 遠(yuǎn)端，形成再灌注損傷。縫合切口，術(shù)畢。放回籠內(nèi)，單籠飼養(yǎng)。小鼠蘇醒后左上肢屈曲、行走時(shí)左側(cè)旋轉(zhuǎn)或左側(cè)肢體癱瘓的小鼠為堵塞成功。假手術(shù)組大鼠只分離、暴露血管，不結(jié)扎CCA 及ECA，不插入線栓。吡西達(dá)替尼組，術(shù)后連續(xù)給予吡西達(dá)替尼腹腔注射（1mg/kg）7d。DMSO 組小鼠腹腔注射與吡西達(dá)替尼組等體積的DMSO 溶劑。

1.5 神經(jīng)癥狀評(píng)分 參照Longa 的方法進(jìn)行評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0 分為無(wú)明顯神經(jīng)功能缺損癥狀；1 分為不能完全伸展左側(cè)前爪；2 分為向左側(cè)旋轉(zhuǎn)；3 分為行走時(shí)向左側(cè)傾倒；4 分為不能自行行走，意識(shí)障礙。采用雙盲方式對(duì)小鼠術(shù)后行為進(jìn)行評(píng)估。

1.6 標(biāo)本和檢測(cè)指標(biāo) 麻醉所有小鼠，將每組3 只小鼠的大腦進(jìn)行冰凍切片包埋。對(duì)冰凍標(biāo)本進(jìn)行Iba1免疫熒光檢測(cè)，觀察腦缺血后大腦皮層中Iba1 表達(dá)的改變。每組4 只小鼠大腦皮層組織用于實(shí)時(shí)熒光定量多聚核苷酸鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（QPCR）檢測(cè)（TaKaRa 公司RNA 提取試劑說(shuō)明書(shū)，提取組織中的總RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，并測(cè)定mRNA 的表達(dá)量），觀察小膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)炎癥因子TNF-α、IL-10、Arg1 和iNOS 的表達(dá)。引物序列見(jiàn)表1。剩下每組3 只小鼠大腦皮層組織用于Western Blot，觀察NLRP3、NF-κB 和活化的Caspase1 的蛋白表達(dá)變化。

表1 TNF-α、IL-10、Arg1、iNOS和β-Actin的引物序列

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，對(duì)于屬于正態(tài)分布的五組數(shù)據(jù)應(yīng)用單因素方差分析比較，并進(jìn)行兩兩比較的q 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 吡西達(dá)替尼緩解腦缺血小鼠神經(jīng)功能損傷 神經(jīng)癥狀評(píng)分能夠評(píng)估各組小鼠的神經(jīng)行為功能情況。評(píng)分越高，神經(jīng)損傷越嚴(yán)重。對(duì)照組和假手術(shù)組神經(jīng)功能評(píng)分為0，說(shuō)明這兩組小鼠無(wú)損傷；腦缺血組和DMSO 組小鼠神經(jīng)功能損傷顯著，分別為（3.33±0.51）分和（3.16±0.75）分，與正常組比較，P＜0.001；吡西達(dá)替尼組神經(jīng)功能損傷明顯減輕為（1.83±0.75）分，與腦缺血組和DMSO 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。

2.2 吡西達(dá)替尼減少腦缺血再灌注小鼠大腦皮層Iba1的表達(dá) 免疫熒光檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白Iba1 在吡西達(dá)替尼治療前后的表達(dá)變化（見(jiàn)圖1）。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組和對(duì)照組比較，腦缺血組和DMSO 組的Iba1 表達(dá)顯著增加（P＜0.001）。相對(duì)于腦缺血組，吡西達(dá)替尼組的Iba1 表達(dá)降低（P＜0.01）（見(jiàn)表2）。結(jié)果表明，吡西達(dá)替尼能夠有效地抑制小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白Iba1 的表達(dá)。

表2 各組小鼠大腦皮層Iba1表達(dá)比較（±s）

表2 各組小鼠大腦皮層Iba1表達(dá)比較（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.001；與腦缺血組比較，#P＜0.01

組別 正常組 假手術(shù)組 腦缺血組 DMSO 組 吡西達(dá)替尼組Iba1 表達(dá) 1.01±0.41 1.10±0.30 2.70±0.14* 2.40±0.17 2.10±0.23#

2.3 吡西達(dá)替尼治療能夠抑制腦缺血后小膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)炎癥因子的表達(dá) 通過(guò)QRT-PCR 法觀察腦缺血后小鼠大腦皮層小膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)炎癥TNF-α、iNOS、IL-10、Arg-1 的表達(dá)變化。結(jié)果表明，與對(duì)照組比較， 腦 缺 血 組TNF-α、iNOS、IL-10、Arg-1 因 子的mRNA 表達(dá)顯 著 增 加（P＜0.01、P＜0.001）。相 對(duì)于腦缺血組，吡西達(dá)替尼組TNF-α、iNOS、IL-10、Arg-1 因子的mRNA 表達(dá)顯著降低（P＜0.05、P＜0.01、P＜0.001）（見(jiàn)表3）。結(jié)果表明，吡西達(dá)替尼通過(guò)抑制小膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)因子TNF-α、iNOS、IL-10、Arg-1的表達(dá)而發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用。

表3 各組小鼠大腦損傷部位TNF-α、iNOS、IL-10和Arg-1mRNA表達(dá)比較（±s）

表3 各組小鼠大腦損傷部位TNF-α、iNOS、IL-10和Arg-1mRNA表達(dá)比較（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.01，#P＜0.001；與腦缺血組比較，▲P＜0.05，△P＜0.01，△△P＜0.001。TNF-α：腫瘤壞死因子α；iNOS：誘導(dǎo)型一氧化氮合酶；IL-10：白介素10；Arg-1：精氨酸酶1

組別 正常組 假手術(shù)組 腦缺血組 DMSO 組 吡西達(dá)替尼組TNF-α 4.29±1.14 4.83±0.64 9.49±0.45# 10.21±1.14 7.04±0.50 △△iNOS 2.62±0.94 2.50±0.45 6.49±0.45# 6.88±0.41 4.70±0.77 △IL-10 1.23±0.21 1.17±0.16 2.43±0.11* 2.40±0.10 1.91±0.06 ▲Arg-1 1.80±0.17 1.89±0.25 3.43±0.10* 3.40±0.12 2.01±0.02 △△

2.4 吡西達(dá)替尼抑制腦缺血組NLRP3 信號(hào)通路 Western Blot 結(jié)果顯示，在假手術(shù)組和對(duì)照組小鼠中，NLRP3、NF-κB 和Caspase1 低表達(dá)。腦缺血組和DMSO 組NLRP3、NF-κB 和活化的Caspase1 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）。與腦缺血組和DMSO組比較，吡西達(dá)替尼組NLRP3、NF-κB 和活化的Caspase1 蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.01、P＜0.001）（見(jiàn)圖2、表4）。

圖2 各組NLRP3，NF-κB和活化的Caspase1蛋白表達(dá)圖

表4 各組小鼠大腦皮層NLRP3、NF-κB和活化的Caspase1蛋白表達(dá)比較（±s）

表4 各組小鼠大腦皮層NLRP3、NF-κB和活化的Caspase1蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.001；與腦缺血組比較，#P＜0.01，▲P＜0.001。NLRP3：NOD樣受體蛋白3；NF-κB：核因子κB蛋白；Active-Capase1：活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1

組別 正常組 假手術(shù)組 腦缺血組 DMSO 組 吡西達(dá)替尼組NLRP3 0.51±0.05 0.60±0.10 1.30±0.10* 1.47±0.03 0.87±0.07 ▲NF-κB 0.71±0.05 0.65±0.05 1.13±0.07* 1.13±0.03 0.74±0.09#Active-Capase1 0.38±0.06 0.40±0.04 0.52±0.08* 0.59±0.05 0.36±0.06 ▲

3 討論

吡西達(dá)替尼是集落刺激因子1 受體（CSF1R）的特異性抑制劑，通過(guò)抑制CSF1R 的磷酸化，對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的活性有重要作用。2014 年，吡西達(dá)替尼被美國(guó)食品和藥物管理局（FDA）授予用于治療色素沉著的絨毛結(jié)節(jié)性滑膜炎（PVNS）和腱鞘巨細(xì)胞腫瘤的臨床研究［4］。本次研究首次在基礎(chǔ)研究中證實(shí)吡西達(dá)替尼能顯著抑制NLRP3 炎癥通路，在腦缺血再灌注小鼠中實(shí)現(xiàn)神經(jīng)保護(hù)作用。

膠質(zhì)細(xì)胞免疫治療是治療腦卒中的新趨勢(shì)。腦卒中發(fā)生后，機(jī)體自身的免疫系統(tǒng)會(huì)被激活進(jìn)而通過(guò)免疫細(xì)胞如小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞等的調(diào)節(jié)作用抵御損傷部位氧糖缺失［5］。同時(shí)炎癥反應(yīng)促使機(jī)體釋放大量的TNF-α 和iNOS［6］。TNF-α 的過(guò)度表達(dá)會(huì)加重腦損傷。iNOS 表達(dá)的上調(diào)，使一氧化氮（NO）合成分泌增加，促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞向損傷部位聚集，進(jìn)一步加重腦的損傷［7］。CSF1R 表達(dá)聚集，促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變，釋放IL-10 和Arg1 因子，不利于患者預(yù)后。在本研究中，小鼠局灶性腦缺血損傷誘導(dǎo)TNF-α 和iNOS 的mRNA 表達(dá)顯著增加，小膠質(zhì)細(xì)胞聚集，催化Iba1 表達(dá)增加和IL-10 和Arg1 釋放。而吡西達(dá)替尼能夠有效降低小膠質(zhì)細(xì)胞Iba1 表達(dá)，并抑制TNF-α 和iNOS 的mRNA 表達(dá)以及IL-10 和Arg1 釋放，抑制局部炎癥。

小膠質(zhì)細(xì)胞依賴的CSF1R 炎癥激活在神經(jīng)免疫中起重要作用，尤其是NLRP3 炎性小體介導(dǎo)炎癥反應(yīng)［3］。NLRP3 是NOD 樣受體3，能被機(jī)體各種內(nèi)外源性危險(xiǎn)信號(hào)激活后，通過(guò)活化半胱天冬酶-1（Caspase-1）進(jìn)而促進(jìn) IL-1β、IL-18 的成熟和釋放，引起機(jī)體的炎癥反應(yīng)［8］。既往的多項(xiàng)研究均發(fā)現(xiàn)，NLRP3 的激活能夠增加促炎基因，包括NF-κB、iNOS、IL-10、TNF-α 和Arg-1 的 表 達(dá)［9］。本 研 究結(jié)果顯示，吡西達(dá)替尼能夠顯著減少iNOS、IL-10、TNF-α 和Arg-1 在腦缺血組織的mRNA 表達(dá)，同時(shí)抑制NLRP3 炎癥信號(hào)相關(guān)蛋白NF-κB、活化的Caspase1蛋白的表達(dá)，具有較強(qiáng)的抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上所述，吡西達(dá)替尼顯著降低小膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)炎癥因子的mRNA 表達(dá)，抑制NLRP3 炎癥信號(hào)通路的激活，進(jìn)而減少局灶性腦缺血后的小膠質(zhì)細(xì)胞Iba1的表達(dá)，降低神經(jīng)功能評(píng)分，促進(jìn)腦缺血小鼠神經(jīng)功能恢復(fù)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)神經(jīng)保護(hù)作用。