燈盞花素及燈盞乙素對肝細(xì)胞色素P450 酶體內(nèi)代謝的影響*

李天英，石 迪，鄭 巖，鄭春宇，李秋紅

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱150040）

細(xì)胞色素P450（cytochrome P450，簡稱CYP450）是肝微粒體混合功能氧化酶中最重要的一族，參與許多內(nèi)源性和外源性物質(zhì)的代謝[1]。人類有90%以上經(jīng)肝臟代謝藥物是由CYP450 催化的，其中3 種CYP450 同工酶（2%～4%by CYP2E1、10%by CYP2C9和40%～45%by CYP3A4）參與代謝近60%的藥物[2]。抑制或誘導(dǎo)任何一種CYP450 同工酶都有可能引起不可預(yù)期的，甚至是嚴(yán)重的藥物相互作用，尤其是通過同一種酶代謝的藥物在臨床聯(lián)合應(yīng)用時，極易引起不良反應(yīng)[3]。

燈盞花素是從燈盞花中分離的黃酮類有效成分，研究表明其具有神經(jīng)保護和抗凝血作用[4]。燈盞花素注射液是從中藥燈盞花中提取的燈盞花素制成的無菌水溶液，主要用于治療心腦血管方面的疾病，臨床使用燈盞花素注射液時，聯(lián)合用藥可能是潛在的嚴(yán)重的危險因素[5]。燈盞乙素是燈盞花素的主要藥效成分，主要用于心腦血管類疾病的治療[6]。

目前，尚無燈盞花素注射液及燈盞乙素對CYP450 酶影響的系統(tǒng)研究。燈盞花素注射液及燈盞乙素對CYP450 酶的影響可能引起藥物的相互作用，并潛在的限制了它們的使用。本實驗中，氯唑沙宗、甲苯磺丁脲和咪達(dá)唑侖分別是CYP2E1、CYP2C9 和CYP3A4 的探針底物，研究表明“Cocktail”探針?biāo)幬锓梢栽谕粫r間內(nèi)測定多種CYP450 酶的活性[7]。因此，在上述研究背景下，探討燈盞花素注射液及燈盞乙素對大鼠體內(nèi)CYP2E1、CYP2C9 和CYP3A4 的代謝活性影響，同時比較燈盞花素注射液及燈盞乙素對CYP450 各亞型作用過程中的關(guān)聯(lián)性，具有重要意義。

1 材料與儀器

1.1 藥品及主要試劑

燈盞花素注射液（批號：1011111032，石藥銀湖制藥有限公司）；燈盞乙素（批號：27740018，大連美侖技術(shù)有限公司）；氯唑沙宗原料藥（批號20110701，大連美侖生物技術(shù)有限公司）；甲苯磺丁脲原料藥（批號20110501，大連美侖生物技術(shù)有限公司）；咪達(dá)唑侖注射液（批號20120302，江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司）；色譜甲醇（迪馬科技公司）。

1.2 實驗儀器

LC-2010A 高效液相色譜儀（LC-10ATVP 泵，SPD-10AVP 檢測器，Class-VP 色譜工作站，日本島津）；TDL-60B 型低速臺式離心機（上海榮泰生化工程有限公司，半徑=13cm）；旋渦TQ-1 型混合器（上海琪特分析儀器有限公司）；TGL16M 型高速冷凍離心機（北京眾益中和生物技術(shù)有限公司，半徑=5.5cm）；SK8200H 型超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）。

1.3 實驗動物

清潔級Sprague-Dawley 大鼠（180-220g），雌雄各半，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。合格證號SCXK（黑）2008004。動物實驗均通過倫理委員會批準(zhǔn)同意。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：TopsilTM C18column（250mm×4.6mm,5μm, 上海月旭科技公司），流動相：甲醇：NH4H2PO4（pH 值為3.4）=54∶46，流速：l.0ml·min-1，檢測波長：230nm，柱溫：30℃。

2.2 生物樣品采集

將18 只SD 大鼠隨機分為3 組，即對照組、燈盞花素注射液組及燈盞乙素溶液劑組。對照組大鼠每日于尾靜脈注射生理鹽水，每天一次，連續(xù)7d；燈盞花素注射液組大鼠每天于尾靜脈注射給予燈盞花素注射液5mL·kg-1，每天一次，連續(xù)7d；燈盞乙素組大鼠每天于尾靜脈注射燈盞乙素溶液劑30mg·kg-1，每天一次，連續(xù)7d；第8d 各組均于尾靜脈緩慢注射Cocktail 探針?biāo)幬锶芤海瑒┝糠謩e為甲苯磺丁脲2.5mg·kg-1、氯唑沙宗和咪達(dá)唑侖各5mg·kg-1。分別于注射氯唑沙宗、甲苯磺丁脲和咪達(dá)唑侖的混合溶液前和給藥后5、10、15、20、30min 和1、2、4、8、12、24h 眼內(nèi)毗靜脈取血0.8mL 至肝素化離心管中，3500r·min－1離心10min，分離血漿，血漿樣品在-20℃冷凍保存待分析。

2.3 生物樣品處理

精密移取大鼠血漿樣本200μL，加入內(nèi)標(biāo)溶液20μL（4μg·mL-1的地西泮），搖勻，加入氯仿2.0mL，渦旋5min，3500r·min－1離心10min，取下層有機相1.8mL 于另一試管中，40℃N2吹干，200μL 流動相復(fù)溶，20μL 進樣。

2.4 數(shù)據(jù)分析

采用中國藥理學(xué)會數(shù)學(xué)藥理專業(yè)委員會編制的藥代動力學(xué)軟件程序DAS2.0 非房室模型，求出每只大鼠體內(nèi)氯唑沙宗、甲苯磺丁脲和咪達(dá)唑侖的藥代動力學(xué)參數(shù)，結(jié)果以“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”（x±s）表示，采用單因素方差分析進行組間比較，Dunnett's 檢驗進行兩兩比較。P＜0.05 表示有顯著性差異。

2.5 燈盞花素注射液和燈盞乙素對大鼠體內(nèi)CYP2E1 的影響

各組氯唑沙宗的藥動學(xué)參數(shù)及藥時曲線見表1和圖1。

表1 對照組、燈盞花素組和燈盞乙素組中氯唑沙宗的藥動學(xué)參數(shù)（n=6）Tab.1 Pharmacokinetic parameters of chlorzoxazone after administration of chlorzoxazone（5mg·kg-1）in control,breviscapine injection and scutellarin groups（n=6）

圖1 對照組、燈盞花素組和燈盞乙素組中氯唑沙宗的平均血藥濃度-時間曲線（n=6）Fig.1 Mean plasma concentration-time of chlorzoxazone in control, breviscapine injection and scutellarin groups（n=6）

燈盞花素注射液組及燈盞乙素組分別與對照組比較，氯唑沙宗的藥動學(xué)參數(shù)沒有統(tǒng)計學(xué)差異；燈盞花素注射液組的氯唑沙宗與燈盞乙素組比較，藥動學(xué)參數(shù)沒有顯著性差異。結(jié)果表明燈盞花素注射液及燈盞乙素對大鼠體內(nèi)CYP2E1 沒有影響。

2.6 燈盞花素注射液和燈盞乙素對大鼠體內(nèi)CYP2C9 的影響

各組甲苯磺丁脲的藥動學(xué)參數(shù)及藥時曲線見表2 和圖2。

表2 對照組、燈盞花素組和燈盞乙素組中甲苯磺丁脲的藥動學(xué)參數(shù)（n=6）Tab.2 Pharmacokinetic parameters of tolbutamide after administration of tolbutamide（2.5mg·kg-1）in control,breviscapine injection and scutellarin groups（n=6）

圖2 對照組、燈盞花素組和燈盞乙素組中甲苯磺丁脲的平均血藥濃度-時間曲線（n=6）Fig.2 Mean plasma concentration-time of tolbutamide in control, breviscapine injection and scutellarin groups（n=6）

燈盞乙素組的甲苯磺丁脲與對照組比較，AUC(0-t)，AUC(0-∞)，t1/2分別增加了34.2%，43.4%和56.8%（p＜0.05），CL 減小了57.89%（p＜0.05）；而燈盞花素注射液組的甲苯磺丁脲與燈盞乙素組比，AUC(0-t)，AUC(0-∞)，MRT(0-∞)，t1/2分別增加了48.9%，52.7%，39.8%和65.6%（p＜0.05），CL 減小了52.9%（p＜0.05）。燈盞花素注射液組的甲苯磺丁脲與對照組相比，藥動學(xué)參數(shù)沒有統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)果表明燈盞乙素對大鼠體內(nèi)CYP2C9有潛在的抑制作用，但是燈盞花素注射液對大鼠體內(nèi)CYP2C9 的活性沒有影響。

2.7 燈盞花素注射液和燈盞乙素對大鼠體內(nèi)CYP3A4 的影響

各組咪達(dá)唑侖的藥動學(xué)參數(shù)及藥時曲線見表3和圖3。

表3 對照組、燈盞花素組和燈盞乙素組中咪達(dá)唑侖的藥動學(xué)參數(shù)（n=6）Tab.3 Pharmacokinetic parameters ofmidazolamafter administration of midazolam（5mg·kg-1）in control, breviscapine injection and scutellarin groups（n=6）

圖3 對照組、燈盞花素組和燈盞乙素組中咪達(dá)唑侖的平均血藥濃度-時間曲線（n=6）Fig.3 Mean plasma concentration-time of midazolam in control, breviscapine injection and scutellarin groups（n=6）

燈盞花素注射液組及燈盞乙素組的咪達(dá)唑侖分別與對照組比較，AUC(0-t)增加了76.9% 和65.4%（p＜0.05），AUC(0-∞)增加了78.6% 和76.6%（p＜0.05），t1/2增加了77.2% 和57.5%（p＜0.05），而且MRT 顯著延長，CL 急劇減慢（p＜0.05）；燈盞花素注射液組的咪達(dá)唑侖與燈盞乙素組比較，藥動學(xué)參數(shù)沒有顯著性差異。結(jié)果表明，燈盞花素注射液組和燈盞乙素組的咪達(dá)唑侖代謝顯著減慢，因此，燈盞花素注射液和燈盞乙素均對大鼠體內(nèi)CYP3A4 有顯著的抑制作用。

3 結(jié)論

燈盞花素注射液不是純的化學(xué)物質(zhì)，而是包含至少9 個化合物的混合物。據(jù)報道[8]，這9 個化合物分別是燈盞乙素、黃芩苷、柚皮素、東莨菪素、山奈酚、芹菜素、木犀草素、咖啡酸和原兒茶酸，其中燈盞乙素的含量占80%以上，是主要有效成分。從植物中分離一種化合物，通常情況下，藥理作用會隨著化合物純度的增加而降低，所以其它化合物可能與主要活性成分起協(xié)同作用[9]。在本實驗中，情況正好相反，燈盞乙素對CYP2C9 的作用明顯高于燈盞花素注射液（p＜0.05），唯一可能的解釋是燈盞花素注射液中其它那8 種成分與燈盞乙素對CYP2C9 產(chǎn)生的作用相反。

據(jù)報道，燈盞花素注射液在大鼠體外肝微粒體中對CYP2E1 和CYP2C9 的活性沒有影響[10]，這一結(jié)果與本課題實驗結(jié)果相同，表明燈盞花素注射液與通過CYP2E1 和CYP2C9 代謝的藥物聯(lián)用時，不會引起藥物之間的相互作用。本研究中，燈盞花素注射液對CYP3A4 有抑制作用，而燈盞乙素是CYP2C9和CYP3A4 抑制劑，但是燈盞乙素對CYP2E1 的活性沒有影響。另外，燈盞花素注射液組與燈盞乙素組對CYP450 酶活性進行比較，結(jié)果表明燈盞花素注射液與燈盞乙素對CYP2E1 和CYP3A4 活性的影響沒有顯著不同，說明燈盞乙素可能是燈盞花素注射液中對CYP2E1 和CYP3A4 產(chǎn)生作用的活性成分。本實驗結(jié)果表明，燈盞花素注射液對大鼠體內(nèi)CYP3A4 有抑制作用，對CYP2E1 和CYP2C9 沒有影響；而燈盞乙素對CYP2C9 和CYP3A4 有潛在的抑制作用，但對CYP2E1 沒有影響。以上結(jié)果可為臨床上避免出現(xiàn)藥物相互作用提供實驗依據(jù)。