飼料及飼料原料中霉菌毒素快速檢測技術(shù)研究進(jìn)展

孟衛(wèi)芹 王金良 沈志強(qiáng),* 陳金龍

1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州256600；2.山東綠都生物科技有限公司，山東濱州256600

霉菌毒素(mycotoxins) 是一類低分子質(zhì)量化合物，是由霉菌或者絲狀真菌在適宜條件下產(chǎn)生的有毒次生代謝產(chǎn)物[1]，廣泛存在于糧食、飼料及飼料原料中，動物食用感染的飼料可引起機(jī)體多種中毒癥狀甚至死亡，并可通過食物鏈威脅人類健康。根據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）統(tǒng)計，全球每年約有25%的農(nóng)作物受到霉菌毒素不同程度的污染，約2%的農(nóng)作物因污染嚴(yán)重失去應(yīng)用價值，由此造成的經(jīng)濟(jì)損失可達(dá)數(shù)千億美元。我國是家畜養(yǎng)殖大國，畜牧業(yè)也是我國農(nóng)業(yè)的重要支柱產(chǎn)業(yè)，而微量的霉菌毒素便可產(chǎn)生巨大的毒害作用，對我國畜牧業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展和人類食品安全構(gòu)成了巨大挑戰(zhàn)[1-3]。因此，快速、準(zhǔn)確檢測飼料及飼料原料中霉菌毒素含量，是保障動物和人類健康的重要手段，現(xiàn)對國內(nèi)外霉菌毒素及其快速檢測方法進(jìn)行綜述。

1 霉菌毒素的主要種類及危害

目前，可產(chǎn)生霉菌毒素的真菌主要來自曲霉菌屬、鐮刀菌屬、麥角菌屬、鏈格孢屬以及青霉菌屬。發(fā)現(xiàn)的霉菌毒素種類已超過500 種，在飼料及原料中常見、且對動物健康危害嚴(yán)重的霉菌毒素主要有6 種，即黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素、赭曲霉毒素A、伏馬毒素B1、T-2 毒素，這些毒素即使在飼料及飼料原料中含量很低，也會使其營養(yǎng)價值和適口性下降，引起動物免疫機(jī)能下降、生長受阻、繁殖性能降低等，且毒素間的毒副作用具有協(xié)同或加和效應(yīng)[4-5]。飼料中常見霉菌毒素及其危害見表1，殘留在動物組織和動物制品中的霉菌毒素導(dǎo)致食品安全風(fēng)險進(jìn)而影響人類健康。

表1 霉菌毒素及其危害

2 霉菌毒素快速檢測技術(shù)

我國已經(jīng)建立一些飼料中常見霉菌毒素的檢測標(biāo)準(zhǔn)，如GB/T 17480-2008 飼料中黃曲霉毒素B1 的測定（酶聯(lián)免疫吸附法）、GB/T 28716-2012飼料中玉米赤酶烯酮的測定（免疫親和柱凈化- 高效液相色譜法）、GB/T 8381.6-2005 配合飼料中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的測定（薄層色譜法）、NY/T 1970-2010 飼料中伏馬毒素的測定（液質(zhì)法）。這些標(biāo)準(zhǔn)大多采用高效液相色譜法(HPLC)、液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(LC-MS /MS)、薄層層析法(TLC)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)等。TLC 操作簡便，但靈敏度差；儀器檢測靈敏度高，但樣品處理復(fù)雜，且儀器昂貴，標(biāo)準(zhǔn)品消耗大。目前霉菌毒素殘留檢測技術(shù)的發(fā)展趨勢，要求樣品提取方便、試劑耗用少、在線自動化處理、多組分高通量地快速檢測。因此，快速檢測技術(shù)必將成為霉菌毒素殘留檢測研究的重點。

2.1 酶聯(lián)免疫吸附法

酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）是利用酶分子與抗原或抗體相結(jié)合，然后用酶標(biāo)記的抗原或抗體，與固定在聚苯乙烯材料上的抗體或抗原發(fā)生特異性反應(yīng)，通過洗滌使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，經(jīng)底物液反應(yīng)顯色，測定光學(xué)信號強(qiáng)度，進(jìn)而確定待檢物的含量。ELISA 方法比膠體金免疫層析快速檢測技術(shù)靈敏度更高，具有低成本、快速、操作簡單、便捷等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、食品和飼料檢測領(lǐng)域。龔阿瓊等[4]采用ELISA 法檢測了我國飼料原料及配合飼料中AFB1、ZEN、DON的含量。李衛(wèi)娟等[5]通過ELISA 法對牧草、秸稈、青貯等反芻動物飼料中 AFB1、DON、ZEN、FB1 進(jìn)行定量檢測。

2.2 化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法

化學(xué)發(fā)光酶免疫分析方法（CLEIA）是將化學(xué)發(fā)光分析和酶免疫反應(yīng)相結(jié)合而建立的一種測定方法，兼具有化學(xué)發(fā)光的高靈敏性和抗原抗體反應(yīng)的高度特異性，與傳統(tǒng)ELISA 的主要區(qū)別是顯色系統(tǒng)的不同，比常規(guī)酶免疫分析法的靈敏度提高了3～5個數(shù)量級。因化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)靈敏度高、特異性強(qiáng)、成本低廉、快速穩(wěn)定、檢測范圍廣、操作簡便、自動化高等優(yōu)點而被廣大研究技術(shù)人員認(rèn)可與推廣，廣泛應(yīng)用于食品安全、環(huán)境檢測、醫(yī)藥科學(xué)和臨床疾病診斷等方面，成為藥物殘留檢測發(fā)展的一種趨勢。葉云峰等[6]采用化學(xué)發(fā)光免疫分析方法實現(xiàn)了糧食作物中的OTA 殘留的快速檢測。

2.3 免疫層析法

免疫層析法（IC）是以免疫滲濾為基礎(chǔ)發(fā)展起來的一種簡便快速的檢測方法，其原理是將特異的抗體固定于硝酸纖維素膜的某一區(qū)帶，當(dāng)一端浸入樣品后，由于毛細(xì)管的作用，樣品將沿著該膜向前移動，當(dāng)移動至固定有抗體的區(qū)域時，樣品中相應(yīng)的抗原即與該抗體發(fā)生特異性結(jié)合，根據(jù)顏色反應(yīng)從而實現(xiàn)樣品的特異性免疫診斷。該方法具有操作簡便、快速經(jīng)濟(jì)、靈敏度高且不需要昂貴的儀器設(shè)備等優(yōu)點，特別適用于大批量樣本的快速篩查和基層檢測。隨著免疫層析技術(shù)的迅猛發(fā)展，多種納米材料標(biāo)記物被應(yīng)用于免疫層析試紙條，常見的有膠體金、熒光微球、量子點等，呈現(xiàn)出高靈敏度、可定量檢測、多元檢測的發(fā)展趨勢。與ELISA 法相比，雖然膠體金免疫層析試紙條檢測限高，但大大縮短了檢測時間。為了提高靈敏度，Wang 等[7]用熒光微球標(biāo)記FB1 單克隆抗體，建立了一種檢測玉米中FB1的免疫層析法，與FB2 和FB3 的交叉反應(yīng)率分別為1.5%和67.3%，回收率在90%以上。肖理文等[8]通過熒光納米微球標(biāo)記玉米赤霉烯酮抗體和羊抗雞抗體，研發(fā)的玉米赤霉烯酮熒光定量試紙條，在樣品中檢測添加回收率為90%以上，3 次重復(fù)的變異系數(shù)在13.11%以內(nèi)，與其他真菌毒素的交叉反應(yīng)率均小于5%，滿足快速、簡便、準(zhǔn)確定量的需求。李鑫[9]研制的多元膠體金免疫層析試紙條，可同時檢測AFB1、OTA 和ZEN 等3 種組分，檢測限分別為0.25、0.5、1 ng/mL，該試紙條特異性好，3 種真菌毒素之間無交叉反應(yīng)，滿足多組分同步檢測的需要，在飼料真菌毒素混合污染同步快速檢測中具有應(yīng)用前景。

2.4 核酸適配體生物傳感器

核酸適配體(aptamer)是利用體外篩選技術(shù)得到的一種功能與抗體相似的寡核苷酸片段，可與多種目標(biāo)物質(zhì)高特異性、高選擇性地結(jié)合，如蛋白質(zhì)和藥物等，被廣泛應(yīng)用于生物傳感器領(lǐng)域。基于核酸適配體的生物傳感器具有易合成、易標(biāo)記、易修飾、靈敏度高、特異性高、分子質(zhì)量小、檢測成本低等優(yōu)勢而受到廣泛的關(guān)注。桂海孌等[10]利用非標(biāo)記熒光染料PicoGreen 與雙鏈核酸結(jié)合的特異性，建立了一種快速檢測伏馬毒素B1 的核酸適配體方法，該方法的最低檢測限為 0.1 μg/L，線性范圍為0.1～1 μg/L，整個檢測流程可在40 min 內(nèi)完成。喬勤勤等[11]設(shè)計的一種新型光子晶體編碼懸浮陣列適配體，可同時量化和鑒定谷類樣品中的OTA 和FB1。這些傳感器具有操作簡單、靈敏度高、親和力高等優(yōu)點，并且同時檢測2 種霉菌毒素的適配體傳感器對之后同時檢測多種霉菌毒素的傳感器的發(fā)展提供了新的研究方向。

3 總結(jié)與討論

霉菌毒素快速檢測方法是在免疫學(xué)的基礎(chǔ)上結(jié)合膠體金、酶標(biāo)記、熒光免疫、核酸適配體等技術(shù)開發(fā)出的快速、高靈敏度、高特異性的檢測方法。霉菌毒素的危害性現(xiàn)已被人們高度重視，而霉菌毒素的快速、準(zhǔn)確檢測方法是當(dāng)今研發(fā)人員亟需解決的問題。通過廣泛查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)2 個問題：一是飼料中多種霉菌毒素共存的現(xiàn)象非常普遍，而多數(shù)檢測方法只針對一種霉菌毒素，應(yīng)該建立混合污染免疫檢測技術(shù)，如研究一種便攜、親和力強(qiáng)、成本效益高的核酸適配體通過多種修飾，同時檢測多種霉菌毒素的快速檢測技術(shù)；二是隱蔽型霉菌毒素的檢測問題，隱蔽型霉菌毒素是指霉菌毒素通常以與糖和氨基酸等極性物質(zhì)共軛的方式同時存在，難以通過常規(guī)分析方法檢測出，對動物和人類健康存在潛在風(fēng)險。對于隱蔽型真菌毒素的測定思路，目前國外主要采用色譜法，學(xué)者提出理論上免疫組化法是可以替代色譜法的快速且經(jīng)濟(jì)的方法，但仍處于起步階段，密切關(guān)注學(xué)習(xí)國外新技術(shù)、新方法，研發(fā)出新型霉菌毒素快速檢測技術(shù)，對加強(qiáng)動物飼料安全監(jiān)控，保證人們食品安全與身體健康，促進(jìn)社會經(jīng)濟(jì)穩(wěn)定發(fā)展具有重大意義。