摘要：[目的]轉crylAa基因棉花南農6號為我國未經批準商業(yè)化種植的棉花品種。為監(jiān)測其非法種植，解決陽性標準品不容易獲得的問題，構建適合轉cylAa基因棉花南農6號品系特異性檢測的質粒分子pMD-NN6，以該質粒分子作為標準物質，建立相應的實時熒光定量PCR方法。[方法]根據南農6號轉化體特異序列和棉花內標準基因acpl設計引物，采用重疊PCR方法構建質粒分子;以質粒分子作為標準物質，南農6號轉化體特異序列為靶標，建立了南農6號棉花特異性定量檢測方法。[結果]構建的質粒全長為3148bp，含有南農6號品系特異性序列和棉花acpl基因序列兩個靶標片段的質粒分子，定量標準曲線斜率和擴增效率均符合要求，定量檢測限為30拷貝。兩個已知南農6號含量的混合樣品（2.0%和0.5%）定量檢測的準確度標準偏差均在土25%范圍內，精確度相對標準差均S25%。[結論]建立的PCR定量檢測方法可以用于含有南農6號轉基因棉花產品的品系特異性定量檢測，所構建的標準質粒pMD-NN6可以代替其基因組DNA作為標準物質使用。

關鍵詞：抗蟲棉;質粒分子;acpl基因;crylAa基因;品系特異性實時PCR

中圖分類號：S562

文獻標志碼：A

文章編號：1008-0384（2020）06-0569-07

0引言

[研究意義]棉花是我國大面積商業(yè)化種植的轉基因作物。2017年最新統(tǒng)計數據表明，我國轉基因棉花種植面積為290萬hm，達到了棉花種植總面積的95%以上。目前我國批準種植的棉花品種僅2018年就達到了330多個品種，包括美國孟山都公司的MON531和中國農業(yè)科學院生物技術研究所的國抗系列GK12和sGK321等。另外，MON15985、LLcotton25、抗蟲棉花COT102、GHB614、MON1445、MON88913等品系被允許進口用作加工原料。轉基因抗蟲棉外源基因類型以crylAc基因和crylAb/Ac融合基因為主，還有一部分CpTItcrylA基因，品種多、來源廣（http：//www.moa.gov.cn/ztzl/zjyqwgz/spxx/index1.htm）。轉crylAa基因棉花南農6號（F代，下同）為一種未經批準商業(yè)化種植的棉花品種，國外也尚未見商業(yè)化種植的報道，但是在我國的棉花種植中被檢測到”。因此，開發(fā)快速的特異性檢測方去，用來監(jiān)測轉crylAa基因棉花南農6號的非法種植是非常必要的。[前人研究進展]目前，PCR技術是轉基因作物檢測中應用最為廣泛的技術。實時熒光定量PCR技術以其特異性強、重復性好、靈敏度高和高通量等優(yōu)點成為PCR技術的首選。其檢測的靶標包括轉基因元件、構建特異性序列、基因特異性序列和轉化體（品系）特異性序列。其中，品系特異性檢測的特異性最強。轉基因棉花MON531、MON757、GK12、MON15985和MON88913等的品系特異性實時熒光定量PCR方法均有報道"7。我國對轉基因植物及其成分雖然實施沒有閾值的標識制度，但制定實施了一系列標準，包括主要轉基因成分的檢測標準如35S啟動子、tnos終止子、Bt基因、gus基因、CpTI基因等。轉基因抗蟲棉花Lcotton25、MON88913、MON1445等的定性PCR檢測標準陸續(xù)建立起來一叫，并建立了專門針對crnylAa基因表達盒特異性檢測方法”。王葉等對轉crylAa基因棉花南農6號F1的整合結構進行了解析，獲得213bp的5'旁側序列，并以基因組DNA為標準品，建立了實時熒光定量PCR方法叫。[本研究切人點]植物基因組DNA是轉基因實時熒光定量檢測常用的標準品，但是不容易大量獲得、純度也較低，長期放置穩(wěn)定性差。近幾年，質粒分子因為穩(wěn)定性好、成本低、純度高、容易獲得的優(yōu)勢，在轉基因檢測領域逐漸發(fā)展成為廣受歡迎的一種基因組DNA替代品嗎。作為定性檢測的陽性對照和定量標準物質，質粒DNA更適合對多個靶標基因同時檢測明。基于質粒分子作為標準物質的轉crylAa基因棉花南農6號的定量方法尚未見報道。[擬解決的關鍵問題]本研究構建含有crylAa基因棉花南農6號品系特異性序列和棉花acpl內標準基因兩個靶標的質粒分子，以該質粒分子作為標準品，建立適合南農6號品系特異性定量檢測的實時熒光定量PCR方法，有效解決了陽性基因組DNA標準品不容易獲得的問題，實現對南農6號品系非法種植的有效監(jiān)測。

1材料與方法

1.1材料準備和DNA提取

抗蟲棉南農6號（江蘇神農大豐種業(yè)科技有限公司，國審2005016）種子由當地種子市場購買。其他棉花樣品均由中國農業(yè)科學院植物保護研究所轉基因植物環(huán)境安全監(jiān)督檢驗測試中心提供，采用植物基因組提取試劑盒提取單粒棉花基因組DNA。

1.2引物和探針

引物和探針的詳細信息如表1所示。質粒構建引物、特異性引物和定量引物根據南農6號轉化體特異序列（登錄號HQ233648）設計。棉花acpl基因作為內標準基因，根據國家標準設計則。本研究所有引物和探針均采用Primer2.0軟件（AppliedBiosystems，FosterCity，CA）設計。引物由北京三博遠志生物技術有限責任公司合成。探針由上海英俊生物技術公司合成，5'端和3'端分別標記FAM熒光基團和BHQl猝滅基團。

1.3重組質粒分子的制備

采用重疊PCR方法使用兩對引物acpl-F/R和acp-mn6/nn6-QR，以南農6號基因組DNA為模板，分別擴增并連接南農6號品系特異性片段和棉花acpl內標準基因片段。獲得的重組片段轉化大腸桿菌JM110感受態(tài)細胞，進行克隆、測序。

1.4質粒DNA提取和稀釋

經測序驗證序列正確的重組質粒菌液于37C搖培至對數生長期，提取質粒DNA，分別用分光光度計和0.8%凝膠電泳檢測其完整性并測定濃度。

用超純水將質粒DNA稀釋為3X10～3X10'拷貝的7個系列濃度梯度（相當于每每應分別加入3X10'～3X10'拷貝質粒DNA），用于建立標準曲線和定量方法的評價。標準曲線建立，每個濃度梯度重復測3次，每次3個平行;定量方法評價，每個濃度重復測3次，每次4個平行。

1.5兩個南農6號混合樣品的制備

使用南農6號單粒種子和非轉基因棉花單粒種子制備2.0%和0.5%兩個不同質量百分比含量的混合樣品。提取DNA作為模板用于定量方法對實際混合樣品的檢測，驗證準確度和精確度。每個樣品DNA重復測3次，每次3個平行。

1.6PCR條件

常規(guī)PCR、重疊PCR、定量PCR反應體系和程序均參照文獻[14]的方法。

2結果與分析

2.1質粒分子構建

使用重疊PCR方法成功構建了含有209bp的南農6號品系特異性序列和210bp的acpl內標準基因序列兩個靶標片段的質粒分子pMD-NN6，為閉合環(huán)

狀雙鏈DNA，全長3148bp，其結構圖和序列詳細信息見圖1。

2.2引物特異性

目前我國市場商業(yè)化種植的抗蟲棉外源基因包括crylAc基因和crylAb/Ac基因2種，轉cryAa基因棉花未允許在我國商業(yè)化種植，包括南農6號。因此本研究選用非轉基因棉花、9個代表性轉基因棉花品種作為陰性對照。其中，皖棉13、中棉35、冀668、中棉所48、中棉所41、魯棉研15為國內轉crylAc基因和crylAb/Ac基因代表性抗蟲棉品種;MON531和MON757為孟山都公司的兩個代表性轉crylAc基因棉花品種，在我國均具有不同程度的市場份額;MON1445為抗除草劑棉花品種。使用特異性引物對南農6號及上述轉基因棉花、非轉基因棉花進行PCR擴增，結果（圖2）表明：僅南農6號獲得了預期201bp擴增，其他轉基因和非轉基因棉花均為陰性?？梢?，該引物能夠特異性區(qū)分出南農6號與其他抗蟲棉品系。

2.3標準曲線的建立

為驗證構建的質粒分子pMD-NN6作為標準物質用于南農6號品系準確定量的適用性，以3X10～3X10'拷貝的7個濃度梯度的質粒DNA作為模板，分別建立了基于南農6號棉花品系特異性序列和棉花acpl內標準基因序列為靶標的兩個標準曲線。標準曲線和擴增圖如圖3所示。品系特異性序列3次重復的PCR擴增效率（E）分別為0.991、0.985和0.994，相關系數（r）分別為0.999、0.999和0.999，均接近于l;acpl內標準基因序列3次重復的擴增效率分別為1.057、1.051和1.041，相關系數（r）分別為0.996、0.998和0.999，也接近于1。以上結果表明，兩個定量反應具有理想的擴增效率，模板起始拷貝數和Ct值之間具有良好的線性關系（表2），建立的兩個標準曲線可以用于南農6號準確定量。

2.4定量方法的可重復性和檢測限

應用建立的定量方法對3X10^～3X10'拷貝的6個濃度梯度的質粒DNA分子進行了定量檢測，3次重復性檢測結果的可重復性標準差（SD）在0.02～0.24，相對標準差（RSD）在0.07%～0.75%，均具有較好的可重復性，表明應用該方法可以準確定量到30個拷貝（表3）。上述結果表明，該方法適合對南農6號的身份鑒定和準確定量，定量方法的檢測限（LOQ）為30個拷貝。

2.5定量方法的準確性和精確性

為進一步驗證定量方法的準確性和精確性，考慮到國際標識管理的需要，對2.0%和0.5%兩個已知南農6號含量的混合樣品進行了定量檢測。校正系數Cfs（Calibrationfactors，品系序列拷貝數lacpl內標準基因拷貝數）用以校正質粒DNA和植物基因組DNA在PCR效率等方面存在的差異而導致定量結果存在的偏差。Cfs值的確定以南農6號基因組DNA.作為模板，測定結果平均Gfs值為0.95（表4）。由公式：樣品轉基因含量=外源目的基因的拷貝數/內標準基因的拷貝數X100%XCfs計算出兩個混合樣品中外源DNA的含量如表5所示，2.0%含量的平均定量檢測值是1.96%，0.5%含量的平均定量檢測值是0.45%。實際測定值和真實值之間的準確度標準偏差（bias）分別為-2.03%和-9.17%，精確度標準差（SD）分別為0.07和0.04，相對標準差（RSD）分別為3.44%和9.04%，均低于土25%可接受值。根據定量PCR反應的校正系數（Cfs）可知，南農6號基因組DNA中品系特異性序列和acpl內標準基因的拷貝數之比為0.95，接近1，因此測定的2.0%和0.5%兩個不同轉基因含量和質量百分比含量是一致的。實際上，國際標識管理規(guī)定的是轉基因含量檢測范圍為5.0%～0.9%。因此，0.5%含量可以滿足轉基因定量檢測的要求，表明質粒分子pMD-NN6可以代替基因組DNA作為定量標準品，建立快速、準確的南農6號實時熒光定量PCR方法，以便實時監(jiān)測南農6號棉花的非法種植。

3討論

在轉基因檢測領域，作為定性檢測的陽性對照和定量標準品，質粒DNA分子替代基因組DNA應用越來越普遍。特別是通過人工插入多個靶標序列，從而實現對高通量檢測，廣泛應用于水稻、玉米、棉花、大豆等作物的轉基因檢測。與基因組DNA作為標準品相比，質粒分子純度高，具有更低的檢測限41618本研究建立的定量方法用于轉crylAa基因棉花南農6號可以檢測到30拷貝，和楊陽等.H報道的基因組DNA作為標準品檢測限44個拷貝相比，具有更高的檢測靈敏度。

標準物質作為一類具有嚴格賦值的用于對其他物質進行定量，或對檢測方法進行評價的物質，其計量的標準化對于轉基因檢測的準確性、可靠性和有效性至關重要。目前，真正能夠溯源的有證標準物質并不多，質粒分子有證標準物質更是僅限于轉基因玉米MON810、NK603、98140等幾種轉化體。作為全球廣泛種植的轉基因棉花，目前尚無可用于檢測的質粒分子有證標準物質，因此質粒分子標準物質的研制是非常必要的。本研究構建的質粒分子pMD-NN6建立的定量方法均滿足國際相關標準的要求，如定量標準曲線的擴增效率（E）和相關系數（r）接近1，混合樣品定量準確度標準偏差（bias）、精確度標準差（SD）和相對標準差（RSD）均《25%。本研究結果一方面可以對轉crylAa基因棉花南農.6號進行特異性檢測和準確定量，以便實時監(jiān)測其非法種植;另一方面可以為轉基因棉花質粒分子標準物質的研制提供參考數據。

另外，南農6號基因組DNA中品系特異性序列和acpl內標準基因的拷貝數之比為1：1，已知acpl內標準基因在棉花基因組中的拷貝數為2拷貝，據此推測南農6號品系特異性序列在棉花基因組DNA中應為2個拷貝，這一結果也進一步驗證了利用質粒分子可以用來確定外源基因拷貝數的應用么，但還需要通過其他的，如sourthern雜交等方法進行確證。

參考文獻：

[1]JAMES c. Global status of commercialized biotech/GM crops： 2016 ISAAA briefs： No.49-l99[R]. New York： ISAAA， 2017：36-37.

[2]中華人民共和國農業(yè)農村部.2018年農業(yè)轉基因生物安全證書批準清單[EB/OL].[2019-09-20].http：//wwwmoa.gov.cn/ztzl/zjyqwgz/spxx/201901/t201901086166293.htm.

[3]孫爻，謝家建，范蔭蔭，等.轉基因抗蟲棉中cryl4a基因表達盒的序列測定和檢測[J].棉花學報，2011，23（3）：224-227.

SUN Y， XIE J J， FAN Y Y， et al. The sequence and detection of the cry1Aa gene expression cassette in transgenic bt cotton [J]. Cotton Science， 2011，23 （3） ： 224-227. （ in Chinese）

[4]YANG L T， PAN A H， ZHANG K W， et al. Identification and quantification of three genetically modified insect resistant cotton lines using conventional and TaqMan real-time polymerase chain reaction methods [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2005， 53 （16） ： 6222-6229.

[ 5] YANG L T， PAN A H， ZHANG K W， et al. Qualitative andquantitative PCR methods for event-specific detection of geneticallymodified cotton Mon1445 and Mon531 [J] . Transgenic Research， 2005， 14 （6） ：817-831.

[6]ERIC CERNY R， DUONG c， HART JL， et al. Cotton event MON88913and .compositionsandmethodsfordetectionthereof：US8071735[P].2011-12-06.

[7]楊陽，王葉，范金杰，等.轉基因棉花MON757轉化體特異性PCR檢測方法及應用[J].農業(yè)生物技術學報，2016，24（6）：908-918.

中華人民共和國國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局.棉花中轉基因成分定性PCR檢測方法：SN/T1199-2003[S].北京：中國標準出版社，2003.

YANG Y， WANG Y， FAN J J， et al. Event-specific PCR detectionmethods of genetically modified cotton （Gossypium hirsutum）MON757 and their application [J]. Journal of AgriculturalBiotechnology， 2016， 24 （6） ：908-918.（in Chinese）

[8]中華人民共和國國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局.棉花中轉基因成分定性PCR檢測方法：SNT1199-2003[S].北京：中國標準出版社，2003.

[9]中華人民共和國農業(yè)部.轉基因植物及其產品成分檢測耐除草劑棉花LLcotton25及其衍生品種定性PCR方法：農業(yè)部1485號公告-10-2010[S].北京：中國農業(yè)出版社，2011.

[10]中華人民共和國農業(yè)部.轉基因植物及其產品成分檢測抗蟲轉Bt基因棉花定性PCR方法：農業(yè)部1485號公告-11-2010[S].北京：中國農業(yè)出版社，2011.

[11]中華人民共和國農業(yè)部.轉基因植物及其產品成分檢測耐除草劑棉花MON88913及其衍生品種定性PCR方法：農業(yè)部1485號公告-12-2010[S].北京：中國農業(yè)出版社，2011.

[12]王葉，謝家建，黃春蒙，等.轉cryl4a基因抗蟲棉整合結構解析及轉化體特異性檢測方法的建立[J].棉花學報，2017，29（4）：307-315.

[13]李亮，王晶，隋志偉，等.轉基因定量檢測用質粒分子標準物質研究進展[J].生物技術通報，2012（2）：48-52.

[14]蘇長青.適合轉基因抗蟲水稻和棉花PCR檢測標準質粒的構建及試用[D].北京：中國農業(yè)科學院，2011.

[15]中華人民共和國農業(yè)部.轉基因植物及其產品成分檢測棉花內標準基因定性PCR方法：農業(yè)部1943號公告-1-2013[S].北京：中國農業(yè)出版社，2013.

[16] EHLERS B， STRAUCH E， GOLTZ M， et al. Nachweis gentechnischerVer?nderungen in Mais mittels PCR [J] . Bundesgesundheitsblatt， 1997， 40 （4） ： 118-121.

[17] SUC Q， XIEJ J， WANG x F， et al. Integrated structure and event-specific real-time detection of transgenic crylAc/SCK rice Kefeng 6 [J]. European Food Research and Technology， 201 1， 232 （2） ： 351-359.

[ 18] KURIBARA H， SHINDO Y， MATSUOKA T， et al. Novel referencemolecules for quantitation of genetically modified maize and soybean [J]. Journal of AOAC INTERNATIONAL， 2002， 85 （5） ： 1077-1089.

[19] Corbisier P， Broeders S， Charels D， et al. Certification of plasmidicDNA containing MON 810 maize DNA fragments（R）. European Commission， Joint Research Centre. Institute for Reference Materials and Measurements， 2007.

[20] Jeynov B， de Andrade E， Broothaerts W， et al. Certification of plasmid

DNAcontainingNK603 maize DNA fragments（R）. EuropeanCommission， Joint Research Centre. Institute for Reference Materials and Measurements， 2011.

[21 ] CAPRIOARA-BUDA M， CORBISIER P， GANCBERG D， et al.Certifcation of plasmid DNA containing 98140 maizeDNAfragments（R）. European Commission， Joint Research Centre. Institute for Reference Materials and Measurements， 201 1.

[22] YANG L T， DING J Y， ZHANG c M， et al. Estimating the copynumber of transgenes in transformed rice by real-time quantitative PCR [J]. Plant Cell Reports， 2005， 23 （10/11） ： 759-763.

（責任編輯：楊小萍）

蘇長青.基于質粒分子的轉crylAa基因棉花定量PCR方法的建立[J].福建農業(yè)學報，2020，35（6）：569-575.