（西寧市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，西寧 630100）

牛衣原體病是由流產(chǎn)嗜性衣原體所引起的牛的一種地方性傳染病，主要癥狀包括發(fā)熱、懷孕母牛繁殖障礙、肺炎、腸炎、多發(fā)性關(guān)節(jié)炎和腦脊髓炎等，被感染母牛多發(fā)生流產(chǎn)、早產(chǎn)和產(chǎn)死胎。流產(chǎn)嗜性衣原體可感染牛和與之密切接觸的人，是一種人畜共患病病原。國內(nèi)的家畜衣原體陽性率比較高[1]。牛衣原體病在世界各地均有發(fā)生，在我國新疆、內(nèi)蒙古等西北地區(qū)多發(fā)，給畜牧業(yè)及公共衛(wèi)生造成不同程度的影響[2～4]。在青海省也有一些牛衣原體的相關(guān)調(diào)查，如祁小英等報(bào)道青海省樂都縣牛衣原體抗體檢測(cè)陽性率為2.16%（5/232）[5]。為了調(diào)查掌握牛衣原體病在西寧市的感染情況，本試驗(yàn)采用間接血凝（IHA）試驗(yàn)檢測(cè)了牛衣原體的陽性率，并通過PCR試驗(yàn)對(duì)間接血凝試驗(yàn)陽性樣本進(jìn)行了確定，旨在為本地區(qū)牛衣原體防控工作提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料

1.1 樣品來源

樣品來自青海省西寧市三縣三區(qū)221個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)（戶），其中散戶172戶，規(guī)模養(yǎng)殖戶41戶，規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)8個(gè)。共采集血液樣品、肛拭子和生殖道拭子各1 255份（其中肉牛各782份，奶牛各383份，牦牛各90份）。血液樣品均由獸醫(yī)通過無菌采集，按常規(guī)方法分離血清，置-20℃保存；肛拭子和生殖道拭子由獸醫(yī)用無菌的棉簽采集，置-20℃保存。并詳細(xì)記錄牛群基本情況，如來源、品種、日齡等。詳見表1和表2。

表1 牛血清樣品統(tǒng)計(jì) 單位：份

表2 肛拭子和生殖道拭子樣品統(tǒng)計(jì) 單位：份

1.2 試劑

衣原體間接血凝抗原、稀釋液、陰性血清、陽性血清（購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，產(chǎn)品號(hào)20180703204）；DNA提取試劑盒，衣原體PCR檢測(cè)試劑盒（購自哈爾濱元亨生物藥業(yè)有限公司，產(chǎn)品號(hào)CHL20190124P）。

2 方法

2.1 間接血凝試驗(yàn)

2.1.1 稀釋血清

96孔板每孔加稀釋液75μL，取待檢血清25μL加入第1孔，以4倍稀釋，從第1孔稀釋至第3孔（即1∶4、1∶16、1∶64），第3孔棄去25μL，孔內(nèi)液體量仍為75μL。同一時(shí)間，在同一板上設(shè)陽性對(duì)照2孔，陰性對(duì)照2孔，空白對(duì)照2孔。

2.1.2 加抗原

在每個(gè)孔中加入抗原25μL，放在微型振蕩器上，振蕩2min后蓋上一次性封口膜，然后在37℃下作用2h判定結(jié)果。

2.1.3 結(jié)果判定

對(duì)照各孔均成立，則被檢血清1∶16孔出現(xiàn)“++”以上者為陽性；1∶4 孔出現(xiàn)“+”以下者為陰性；1∶4孔“++”至 1∶16 孔“+”以下者為可疑。

2.2 PCR試驗(yàn)

2.2.1 拭子樣品處理

采集的拭子保存管里加入1.5mL生理鹽水振蕩混勻，8 000r/min離心2min，取上清液100μL于1.5mL滅菌離心管中，再加入200μL消化液和20μL蛋白酶K，振蕩混勻后，置56℃水浴中消化1h。陽性對(duì)照100μL，加入200μL消化液和20μL蛋白酶K，振蕩混勻后，56℃水浴消化1h。陰性對(duì)照100μL，加入200μL消化液和20μL蛋白酶K，振蕩混勻后，置56℃水浴中消化1h。

2.2.2 病原體核酸提取

從水浴鍋中取出樣品管，待冷卻至室溫后，按操作說明，用DNA提取試劑盒提取衣原體DNA，最后離心管中液體即為模板DNA。

2.2.3 PCR擴(kuò)增

每份總體積20μL，含16μLPCR反應(yīng)液（用前混勻），2μLTaqDNA聚合酶，2μL模板DNA。PCR程序?yàn)椋?4℃ 3min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。

2.2.4 電泳

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠中電泳，110～120V，電泳液為50倍稀釋的TAE電泳液，紫外燈下觀察結(jié)果。

2.2.5 結(jié)果判定

陽性對(duì)照出現(xiàn)294bp擴(kuò)增帶、陰性對(duì)照無帶出現(xiàn)（引物帶除外）時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果成立。被檢樣品出現(xiàn)294bp擴(kuò)增帶為衣原體陽性，否則為陰性。

3 檢測(cè)結(jié)果

間接血凝（IHA）試驗(yàn)和PCR試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果一致。間接血凝試驗(yàn)陽性檢出率為1.51%（19/1255），其中牦牛血清陽性檢出率為0（0/90）、奶牛血清陽性檢出率為1.31%（5/383）、肉牛血清陽性檢出率為1.79%（14/782）。肛拭子和生殖道拭子PCR陽性檢出率均為1.51%（19/1255）。詳細(xì)結(jié)果見表3～4以及圖1～2。

圖1 PCR檢測(cè)結(jié)果1

表3 牦牛、肉牛、奶牛衣原體IHA試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)表 單位：份、%

表4 拭子PCR檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì) 單位：份、%

圖2 PCR檢測(cè)結(jié)果2

4 分析與討論

4.1 據(jù)統(tǒng)計(jì)，西寧市目前牛的養(yǎng)殖量為428 894萬頭，其中湟中縣牛存欄186 765頭，湟源縣牛存欄72 356頭，大通縣牛存欄164 800頭，西寧市市郊牛存欄4 973頭。此次樣品采集來源于青海省西寧市三縣三區(qū)的221個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)（戶），共采集牛血液樣品、肛拭子和生殖道拭子各1 255份，樣品的采集及覆蓋面基本上包括了西寧市牛的主要養(yǎng)殖地區(qū)，基本客觀地反映了西寧市牛衣原體感染的總體情況。

4.2 西寧地區(qū)沒有進(jìn)行衣原體的疫苗免疫，從表3可以看出肉牛、奶牛均存在牛衣原體感染，陽性率分別為1.79%和1.31%，?？傮w陽性率為1.51%。本次試驗(yàn)血清用間接血凝試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)，棉拭子用PCR方法檢測(cè)。間接血凝試驗(yàn)和PCR方法檢出的陽性結(jié)果均一致，說明西寧地區(qū)的衣原體陽性牛全部為野毒感染，不存在疫苗免疫抗體的假陽性結(jié)果，因此可做進(jìn)一步檢測(cè)凈化。

4.3 青海省大部分地區(qū)已經(jīng)成為畜禽衣原體病的自然疫源地，且牛陽性率較羊要高，疫病整體呈逐年上升的趨勢(shì)[6]。動(dòng)物感染衣原體后主要表現(xiàn)流產(chǎn)、肺炎、腸炎、關(guān)節(jié)炎、結(jié)膜炎、腦脊髓炎。衣原體病又是人畜共患的疫病，人感染動(dòng)物衣原體后主要表現(xiàn)為結(jié)膜炎、發(fā)熱、頭痛、肌痛和以陣發(fā)性咳嗽為主的間質(zhì)性肺炎、流產(chǎn)等癥狀[6]。多年來習(xí)慣將牛、羊、豬的流產(chǎn)歸結(jié)為由布魯氏菌感染而引起，并沒有對(duì)衣原體病引起足夠重視。此次調(diào)查發(fā)現(xiàn)，西寧地區(qū)牛衣原體病血清學(xué)陽性率較高，說明因衣原體病引起流產(chǎn)而造成的經(jīng)濟(jì)損失不可小覷[7]。

4.4 圖1和圖2為PCR混樣檢測(cè)結(jié)果，PCR方法特異性好、敏感性高、檢測(cè)周期短、重復(fù)性好，其檢測(cè)快、結(jié)果準(zhǔn)確，能有效節(jié)約時(shí)間，為疫情的快速處置提供了有力的技術(shù)支撐。但PCR檢測(cè)成本較高，所以本次試驗(yàn)先通過混樣檢測(cè)，若樣品中有陽性樣品再逐個(gè)檢測(cè)。IHA靈敏性和特異性強(qiáng)、操作簡單，可以快速得出結(jié)果，此方法適用于衣原體病的大面積篩查。

4.5 此次調(diào)查發(fā)現(xiàn)，西寧地區(qū)養(yǎng)殖的牛存在衣原體感染情況，應(yīng)主要采取以下防控措施：

（1）加強(qiáng)對(duì)調(diào)運(yùn)牛的檢疫檢測(cè)管理，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)為陰性的牛方準(zhǔn)調(diào)運(yùn)。選用有效的消毒藥進(jìn)行場(chǎng)地消毒，衣原體在0.1%甲醛和0.5%石炭酸中經(jīng)24h可被滅活，在75%酒精中1min可被滅活，在含氯消毒劑中1～30min被滅活，5% NaOH溶液浸泡病料3d可以殺滅衣原體。

（2）建立和實(shí)施牛群的衣原體疫苗免疫計(jì)劃。淘汰發(fā)病種公牛；對(duì)再次發(fā)生流產(chǎn)或產(chǎn)弱犢的母牛應(yīng)淘汰；名貴牛可隔離治療。每年除定期進(jìn)行血清學(xué)監(jiān)測(cè)外，應(yīng)定期進(jìn)行免疫接種。

（3）堅(jiān)持自繁自養(yǎng)，建立密閉的飼養(yǎng)系統(tǒng)，杜絕其他動(dòng)物攜帶病原體進(jìn)入。從外面引種時(shí)，應(yīng)進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)，對(duì)有血清陽性、可疑的牛群，嚴(yán)禁引進(jìn)。對(duì)衣原體檢測(cè)陽性的牛及時(shí)進(jìn)行淘汰，逐步達(dá)到凈化。

（4）建立嚴(yán)格的衛(wèi)生消毒制度。嚴(yán)格把好工作區(qū)大門通道消毒、產(chǎn)房消毒、圈舍消毒、場(chǎng)區(qū)環(huán)境消毒。對(duì)流產(chǎn)胎兒、死胎、胎衣要集中無害化處理，同時(shí)用2%～5%來蘇兒或2% NaOH溶液等有效消毒劑進(jìn)行嚴(yán)格消毒，加強(qiáng)產(chǎn)房衛(wèi)生工作，以防新生犢牛感染本病。要防止其他動(dòng)物（如貓、野鼠、犬、野鳥、家禽、牛、羊等）攜帶的疫源性衣原體的侵入和感染牛群。加強(qiáng)養(yǎng)殖場(chǎng)的消毒滅源和動(dòng)物的飼養(yǎng)管理工作，保持畜舍衛(wèi)生和動(dòng)物健康。

（5）進(jìn)一步加大樣品采集的范圍和數(shù)量，加快西寧市牛衣原體病的檢測(cè)凈化工作。