（云南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院，昆明 650201）

牦牛乳口感香濃，具有“高濃度、高比重、高含量”的特點，發(fā)酵牦牛乳是一種以牦牛奶為原料，經(jīng)殺菌、接種發(fā)酵劑發(fā)酵制成的傳統(tǒng)飲品[1]。發(fā)酵乳的質(zhì)量優(yōu)劣與牛奶種類、乳固形物含量、牛奶理化特性及發(fā)酵劑等因素密切相關(guān)。為得到品質(zhì)更好的發(fā)酵乳，多種菌株發(fā)酵是發(fā)酵乳的討論熱點，許榮譽等[2]研究發(fā)現(xiàn)約氏乳桿菌和羅伊氏乳桿菌具有耐強酸的能力和良好的發(fā)酵特性；于素素等[3]發(fā)現(xiàn)含有發(fā)酵乳桿菌的發(fā)酵牦牛乳具有良好的性能及風味；Rodriguezl等[4]用約氏乳桿菌和嗜熱鏈球菌發(fā)酵牛乳，比普通發(fā)酵乳具有更好的物質(zhì)代謝率。發(fā)酵乳的口感與牛奶種類也有關(guān)系，黃友鷹等[5,6]研究發(fā)現(xiàn)，牦牛奶脂肪和干物質(zhì)含量高導致其發(fā)酵制品存在質(zhì)地硬、香味不足等缺點。為提高單一乳發(fā)酵制品的品質(zhì)，國外常把山羊奶與荷斯坦牛奶或水牛奶混合后發(fā)酵[7～9]。

為開發(fā)優(yōu)質(zhì)的發(fā)酵牦牛乳制品，本研究從10株乳酸菌中篩選適合牦牛乳發(fā)酵的3株菌，并與保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌制成發(fā)酵劑。根據(jù)牦牛乳高蛋白質(zhì)和高脂肪的特點，加入荷斯坦牛奶混合發(fā)酵，彌補單一牦牛乳發(fā)酵制品中存在的膻味較重、質(zhì)地較硬等問題，為生產(chǎn)高品質(zhì)牦牛發(fā)酵乳提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

牦牛乳（香格里拉高山牧場）；菌株：保加利亞乳桿菌，嗜熱鏈球菌，植物乳桿菌，嗜酸乳桿菌，干酪乳桿菌，副干酪乳桿菌，嬰兒雙歧乳桿菌，約氏乳桿菌，發(fā)酵乳桿菌，羅伊氏乳桿菌。

1.2 試驗方法

1.2.1 發(fā)酵乳菌株篩選

將10種乳酸菌株分別接種到10mL滅菌MRS培養(yǎng)基中，于37℃恒溫培養(yǎng)活化?；罨蟮木N接種到脫脂牛乳中馴化增殖，菌種接種量為6%、4%、2%，40℃下恒溫培養(yǎng)至凝乳。通過測定發(fā)酵乳的酸度、乳酸菌數(shù)、凝乳時間確定適宜發(fā)酵菌種。

1.2.2 復(fù)合菌種配比

根據(jù)前期試驗，將經(jīng)1.2.1試驗篩選出的3種菌株與保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌按體積比1:1:1:1:1進行馴化（該比例下菌株協(xié)調(diào)共生，發(fā)酵性能最佳）。將馴化后的菌種按5%的添加量接種到脫脂奶粉培養(yǎng)基（含2%pH值6.86的PBS，2%番茄汁、6%胡蘿卜汁、8%馬鈴薯汁）中培養(yǎng)至凝乳，加入冷凍干燥保護劑（20mL/L甘油、8g/L葡萄糖、20g/L抗壞血酸），于-80℃凍結(jié)后于-50℃、1～3MPa冷凍干燥72h，制成直投式復(fù)合發(fā)酵劑，于-20℃冰箱內(nèi)冷藏備用。

1.2.3 發(fā)酵乳加工工藝設(shè)計

原料乳→預(yù)熱（50～60℃）→均質(zhì)（8～10MPa）→殺菌（85℃巴氏殺菌，10～20min）→冷卻→接種→灌裝→發(fā)酵→冷藏后熟→成品。

1.2.4 牦牛奶與荷斯坦牛奶的比例確定

將牦牛奶、荷斯坦牛奶分別按3:1、2:1、1:1、1:2、1:3比例加工制作為發(fā)酵乳，測定其感官評分，pH值、酸度、黏度及持水率，以確定最佳配比。

1.2.5 發(fā)酵乳工藝單因素試驗

以發(fā)酵乳感官評分為指標，分別研究糖添加量（8%、8.5%、9%、9.5%、10%）、菌種添加量（2%、3%、4%、5%、6%）、發(fā)酵溫度（26℃、28℃、30℃、32℃、34℃）、發(fā)酵時間（20h、25h、30h、35h、40h）四個因素對其的影響。

1.2.6 發(fā)酵工藝優(yōu)化

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面Box—Behnken試驗設(shè)計，選取糖添加量、菌種添加量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間進行4因素3水平響應(yīng)面分析，在中心值重復(fù)3次，以發(fā)酵乳感官評分為指標優(yōu)化工藝參數(shù)。

1.3 測定指標

1.3.1 感官評分

組織10人評價小組，從色澤、氣味、滋味及組織狀態(tài)四個方面對發(fā)酵乳進行打分，評分標準如表1所示。

表1 發(fā)酵牦牛乳感官評分表

1.3.2 發(fā)酵牦牛乳理化指標測定

pH值：使用PHSJ-3F型pH計直接測定；持水力：參照Hassan的方法進行測定；酸度：參照GB 5009.239-2016進行測定；蛋白質(zhì)：參照GB5009.5-2016進行測定；脂肪：參照GB5009.6-2016進行測定。

表2 單一發(fā)酵菌種篩選試驗結(jié)果

1.3.3 發(fā)酵牦牛乳風味成分雙乙酰的測定

用三氯乙酸溶液將樣品稀釋后，取10支試管加入0.0、2.0、4.0、6.0、8.0mL標準液（各2支），用蒸餾水補足至10mL后，加入5mL三氯乙酸溶液。一組加0.5mL鄰苯二胺溶液，另一組做空白對照，暗處放置30min后在335nm波長下測定吸光值。雙乙酰含量（mg/L）=吸光度×1.2（換算系數(shù)）[10,11]。

1.3.4 發(fā)酵牦牛乳微生物指標檢測

乳酸菌計數(shù)：參考GB4789.35-2016；大腸菌群計數(shù)：參考GB4789.3-2016；霉菌、酵母計數(shù)：參考GB4789.15-2016。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵牦牛乳菌種篩選

發(fā)酵菌種篩選結(jié)果如表2所示。從表2可以看出，采用發(fā)酵乳桿菌、約氏乳桿菌和羅伊氏乳桿菌制備的發(fā)酵乳色澤為微黃色，口感微酸或較酸，符合消費者的飲用喜好；發(fā)酵氣味濃郁有香氣，無異味；組織狀態(tài)均勻細膩、無沉淀；發(fā)酵時間分別為6h、7.3h和6h，發(fā)酵乳中的活菌數(shù)量為2.8×107cfu/mL、3.8×107cfu/mL和3.7×109cfu/mL，其中羅伊氏乳桿菌是10株菌中發(fā)酵得到活菌數(shù)最多的菌株。李正華[12]發(fā)現(xiàn)羅伊氏乳桿菌制備的發(fā)酵乳滋味純正，香氣濃郁，凝乳質(zhì)地光滑，口感細膩，而且乳酸菌總數(shù)和羅伊氏乳桿菌總數(shù)均達到較高水平；許榮譽等[2]研究發(fā)現(xiàn)約氏乳桿菌和羅伊氏乳桿菌具有良好的發(fā)酵特性；于素素等[3]發(fā)現(xiàn)含有發(fā)酵乳桿菌的發(fā)酵牦牛乳具有良好的性能及風味。本試驗結(jié)果符合上述發(fā)現(xiàn)，故選用發(fā)酵乳桿菌、約氏乳桿菌和羅伊氏乳桿菌作為發(fā)酵劑。

2.2 牦牛奶與荷斯坦牛奶比例的確定

添加不同比例荷坦牛乳的發(fā)酵牦牛乳理化指標和感官評分，見表3和圖1。

表3 不同牛乳添加比例發(fā)酵牦牛乳的理化指標

圖1 不同牛乳添加比例發(fā)酵乳的感官評分

從表3可以看出，隨著荷斯坦牛奶所占比例的升高，發(fā)酵乳的pH值逐漸下降，酸度增大，持水率先升高后下降。酸乳酸度通常在70～80°T口感最佳，當牦牛奶與荷斯坦牛奶比例為3:1和2:1時，發(fā)酵乳酸度分別為77.24°T和80.51°T，風味較好。

由圖1可知，當牦牛奶與荷斯坦牛奶比例為3:1時，發(fā)酵乳質(zhì)地較硬、顏色較黃，符合黃友鷹等[5,6]的報道，因為牦牛奶脂肪和干物質(zhì)含量過高，發(fā)酵牦牛乳會出現(xiàn)質(zhì)地硬、香味不足等缺點。當牦牛奶與荷斯坦牛奶比例為1:1、1:2和1: 3時，發(fā)酵乳有乳清析出，凝乳狀態(tài)較差，感官評分值低。這是因為乳清析出的多少、酸奶的質(zhì)地和口感由發(fā)酵乳的持水力決定，持水力越強則乳清析出越少。根據(jù)劉夢云[13]的研究，發(fā)酵牦牛乳的持水力低于荷斯坦牛發(fā)酵乳，這可能是由于酪蛋白各組分含量和結(jié)構(gòu)不同造成的。荷斯坦牛發(fā)酵乳凝膠的微觀結(jié)構(gòu)空隙較小，交聯(lián)結(jié)構(gòu)大且致密，三維結(jié)構(gòu)中的空穴較少，發(fā)酵乳凝膠的持水力、黏度、硬度和內(nèi)聚性高于單一的發(fā)酵牦牛乳。結(jié)合表3和圖1的結(jié)果，牦牛奶與荷斯坦牛奶比例為2:1時發(fā)酵乳組織狀態(tài)好，感官評分最高，故選用該比例作為最佳比例。

2.3 單因素試驗結(jié)果分析

圖2 不同因素對感官評分的影響

在發(fā)酵過程中，糖添加量、菌種添加量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間均對發(fā)酵乳感官評分影響較大。用牦牛奶與荷斯坦牛奶比例為2:1進行單因素試驗，結(jié)果如圖2所示：

由圖2A可知，隨糖添加量的增加，發(fā)酵乳的感官評分先升高后降低，添加過多糖影響整體甜酸比，導致感官評分下降，故選取最適糖添加量為9%。

由圖2B可知，菌種添加量為4%時感官評分最高，組織狀態(tài)均勻穩(wěn)定，口感爽滑細膩，風味醇厚，酸度適中。故選取最適菌種接種量為4%。

由圖2C可知，隨發(fā)酵溫度升高，發(fā)酵乳感官評分先升高后降低。發(fā)酵溫度為30℃時感官評分最高，此時混合菌相互促進生長，凝乳狀態(tài)較好。高于30℃，后混合菌產(chǎn)酸性增強，乳清析出，乳中的風味物質(zhì)釋放較少，感官評分低，因此選擇30℃為最適發(fā)酵溫度。

由圖2D可知，發(fā)酵時間為30h時發(fā)酵乳感官評分最佳。隨時間延長，乳酸菌繼續(xù)發(fā)酵產(chǎn)酸，導致部分酪蛋白溶解，乳中蛋白凝膠體受到破壞，黏度降低，乳清析出，感官評分降低，故選擇最適發(fā)酵時間為30h。

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化發(fā)酵工藝

2.4.1 響應(yīng)面分析方案與結(jié)果

表4 響應(yīng)面分析方案與結(jié)果

根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，建立Box-Behnken Design中心組合設(shè)計試驗?zāi)Ｐ?，通過擬合二次方程計算最佳工藝組合，選取糖添加量、菌種添加量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間進行4因素3水平響應(yīng)面分析，結(jié)果見表4。

2.4.2 模型建立及顯著性檢驗

利用Design-Expert8.0.6軟件對表4進行多元回歸擬合，得到糖的添加量（X1）、菌種添加量（X2）、發(fā)酵溫度（X3）、發(fā)酵時間（X4）的二次方程為Y=92.33+0.42X1-5.42X2+1.33X3-0.33X4+2.25X1X2-0.50X1X3+0.50X1X4-2.50X2X3+1.00X2X4-1.00X3X4-4.92X12-10.67X22-5.04X32-4.29X42。回歸模型方差分析見表5。

表5 感官評分回歸模型方差分析

由表5可知，感官評分回歸模型顯著性檢驗P=0.0001＜0.01，表明二次多元回歸模型的顯著性為極顯著；感官評分回歸模型失擬性檢驗P=0.3965＞0.05，表明發(fā)酵乳感官評分二次回歸模型與實際試驗擬合性充分，模型失擬不顯著。感官評分回歸模型表明，決定系數(shù)R2=95.61%，信噪比為15.780，CV值為2.48%，說明方程的擬合度和可信度都很高，可用于發(fā)酵乳感官評價。綜上所述，回歸模型擬合程度良好，試驗誤差小，可以準確分析和預(yù)測發(fā)酵乳的感官評分，表明實驗可信度高。由回歸系數(shù)顯著性表明，各因素對發(fā)酵乳感官評分的影響順序為：菌種添加量＞發(fā)酵溫度＞糖添加量＞發(fā)酵時間。

2.4.3 響應(yīng)面分析與工藝優(yōu)化

圖3 -A 糖添加量（X1）、菌種添加量（X2）對感官評分的影響

圖3 -B 菌種添加量（X2）、發(fā)酵溫度（X3）對感官評分的影響

通過觀察圖3中響應(yīng)面的變化情況和等高線的變化可反映出發(fā)酵乳糖添加量（X1）、菌種添加量（X2）、發(fā)酵溫度（X3）和發(fā)酵時間（X4）的交互作用對感官評分的影響，等高線呈橢圓形或馬鞍形則表示兩因素交互作用顯著。因素一次項（X2、X3）、交互項（X1X2、X2X3）及二次項（X12、X22、X32、X42）對結(jié)果影響顯著（P＜0.05）；一次項（X1、X4）、交互項（X1X3、X1X4、X2X4、X3X4）對結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。

圖3-A、3-B為由二次回歸方程擬合得到的響應(yīng)值Y的等高線及三維曲面圖，是回歸方程的形象描述。由圖可知，X1與X2，X3與X4之間交互作用顯著（P＜0.05），對感官評分影響較大。由圖3-A可知，感官評分隨糖和菌種添加量的增加而后趨于平緩，糖和菌種添加量分別為9%、4%，感官評分趨于平緩，與方差分析結(jié)果相符合。由圖3-B可知，感官評分隨菌種添加量和發(fā)酵溫度的增加呈先上升后下降的趨勢，菌種添加量為4%，發(fā)酵溫度為30℃，感官評分趨于平緩，與方差分析結(jié)果一致。得到發(fā)酵乳最佳發(fā)酵工藝條件為：糖添加量9.23%、菌種添加量4%、發(fā)酵溫度28.9℃、發(fā)酵時間30h，感官評分達92.33分。在上述條件下進行驗證試驗，與理論值接近，證明此次試驗有效。

2.5 發(fā)酵牦牛乳的理化指標

表6 發(fā)酵牦牛乳的理化指標

由表6可知，發(fā)酵牦牛乳的pH值為4.13，酸度為80.51°T，符合國家標準規(guī)定；持水率為96.57%，乳清析出少，組織狀態(tài)好；蛋白質(zhì)、脂肪含量分別為5.05g/100g、6.575g/100g，符合國家標準中關(guān)于發(fā)酵牦牛乳蛋白質(zhì)不低于3.8/100g、脂肪含量不低于5.0g/100g的規(guī)定；雙乙酰含量為1.02μg/mL（酸乳中雙乙酰含量為0.90μg/mL時就能賦予酸乳令人愉悅的奶油香氣）[14]。

2.6 發(fā)酵牦牛乳的微生物指標

表7 發(fā)酵乳的微生物指標

由表7可知，發(fā)酵牦牛乳中乳酸菌為3.575×107CFU/mL，符合GB 4789.35-2016相關(guān)規(guī)定。微生物檢驗結(jié)果為大腸菌群＜1MPN/100mL、酵母菌≤100CFU/mL、霉菌≤30CFU/mL，符合相關(guān)國家標準規(guī)定。

3 結(jié)論

牦牛奶具有高蛋白質(zhì)和高脂肪的特點，因此牦牛發(fā)酵乳是一款營養(yǎng)價值極高的飲品。研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵乳桿菌、羅伊氏乳桿菌和約氏乳桿菌具有良好的產(chǎn)香產(chǎn)酸能力，適合發(fā)酵牦牛乳，與保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌按1:1:1:1:1比例復(fù)配制成發(fā)酵劑，可有效改善發(fā)酵牦牛乳表層狀態(tài)不佳、組織粗糙、酸香味不足的問題；在發(fā)酵牦牛乳時混合加入荷斯坦牛奶，能彌補單一牦牛發(fā)酵乳中存在的氣味不佳、質(zhì)地較硬等問題。通過單因素試驗和響應(yīng)面優(yōu)化，探尋出了發(fā)酵牦牛乳的最佳工藝條件，為生產(chǎn)一款風味獨特、符合食品質(zhì)量標準的牦牛乳品提供了依據(jù)。