氫離子阻斷CCL5-CXCL4異構(gòu)體通過(guò)減弱白細(xì)胞募集和內(nèi)皮增生改善心肌梗死后心功能的機(jī)制

詹莉 代菁 劉超

(1武漢市第八醫(yī)院心血管內(nèi)科，湖北 武漢 430010；2江漢大學(xué)附屬醫(yī)院 武漢市第六醫(yī)院心電圖室；3天津市胸科醫(yī)院心血管病研究所)

心肌梗死(MI)是發(fā)達(dá)國(guó)家最常見(jiàn)的死亡原因之一，因此尋找新的預(yù)防和治療MI策略是首要任務(wù)。冠狀動(dòng)脈粥樣硬化是血管阻塞后急劇缺乏血液供應(yīng)導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡并引起許多炎癥因子的顯著上調(diào)。通過(guò)再灌注療法有效治療急性MI促進(jìn)血流恢復(fù)至缺血心肌。低濃度氫氣或氫離子或氫氣飽和生理鹽水對(duì)多種疾病具有神奇的保護(hù)作用，包括心肌缺血再灌注損傷。炎癥反應(yīng)在再灌注期間繼續(xù)損傷心臟組織，這可能導(dǎo)致進(jìn)一步不可逆的心肌細(xì)胞死亡。炎癥反應(yīng)也可用于制備心肌組織和修復(fù)駐留細(xì)胞〔1〕。最近顯示嗜中性粒細(xì)胞將巨噬細(xì)胞極化為修復(fù)表型，表明嗜中性粒細(xì)胞(白細(xì)胞的一種)在MI相關(guān)炎癥中的作用〔2～5〕。

趨化因子是與特異性G蛋白耦聯(lián)受體(GPCR)結(jié)合并發(fā)揮不同功能的小細(xì)胞因子，趨化因子能調(diào)節(jié)白細(xì)胞的活化并協(xié)調(diào)它們對(duì)炎癥部位的運(yùn)輸〔6〕。趨化因子(CCL)5和血小板因子(CXCL)4儲(chǔ)存在血小板的分泌性α-顆粒中，是有效的中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞引誘劑〔7，8〕。此外，這些趨化因子顯示出嗜異性相互作用，CCL5-CXCL4異構(gòu)體募集單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞方面特別有效〔9～12〕。由于CCL5的實(shí)驗(yàn)性抑制在心肌再灌注期間顯示出心臟保護(hù)作用〔13～15〕，假設(shè)阻斷CCL5-CXCL4相互作用將在MI的早期階段具有治療益處，可能對(duì)MI具有治療效果。本研究評(píng)估了氫離子處理對(duì)心肌缺血再灌注小鼠模型中心肌組織和心臟功能的影響。

1 資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性C57BL/6J小鼠，10周齡，重約25 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。飼養(yǎng)于空調(diào)室內(nèi)，光照周期為12 h 20℃±2℃和50%～60%濕度，飲用水均經(jīng)過(guò)滅菌處理。

1.2心肌缺血模型 實(shí)驗(yàn)所用動(dòng)物用5%異氟烷麻醉，在呼吸機(jī)支持下通過(guò)做中線頸部切口暴露左頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，用尼龍縫合線縫合頸總動(dòng)脈，并將縫合線推進(jìn)至頸動(dòng)脈分叉處約9 mm處，以閉塞大腦中動(dòng)脈(MCA)，心肌缺血60 min建立心肌缺血再灌注模型。在假手術(shù)組中，進(jìn)行了相同的手術(shù)，但沒(méi)有將縫合線插入MCA。共有30只小鼠隨機(jī)分組，包括10只假手術(shù)小鼠和20只心肌缺血小鼠，用于整個(gè)實(shí)驗(yàn)。所有實(shí)驗(yàn)程序由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心批準(zhǔn)，并且根據(jù)動(dòng)物使用和護(hù)理指南進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3實(shí)驗(yàn)處理 將 20只心肌缺血小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組與氫離子組，每組10只，對(duì)照組和假手術(shù)組采用預(yù)先用氧平衡(體積分?jǐn)?shù)95%O2+5%CO2)的37℃空白灌流液(K-R液)灌注，氫離子組采用預(yù)先用氧平衡(體積分?jǐn)?shù)95%O2+5%CO2)的37℃ K-R液+氫離子灌注(0.6 mmol/L pH7.3)。實(shí)驗(yàn)完畢后取材，伊文藍(lán)染色觀察兩組大鼠心肌組織的心肌病理學(xué)改變，測(cè)定心肌組織中白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量。

1.4研究方法

1.4.1RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)分析 使用TRIzol試劑(Invitrogen)分離總RNA。使用Prime-Script RT試劑盒(日本TaKaRa公司)合成逆轉(zhuǎn)錄的互補(bǔ)DNA。常規(guī)PCR用于使用特異性正向引物測(cè)定miRNA表達(dá)，并且使用小核RNA互補(bǔ)的通用反向引物作為內(nèi)部對(duì)照。CCL5和CXCL4的PCR引物設(shè)計(jì)：CCL5：上游引物TCAGGTCATCACTATCGGCAAT，下游引物AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA；CXCL4：上游引物CCCATCTATGAGGGTTACGC，下游引物TTTAATGTCACGCACGATTTC ；β-actin：上游引物AACAGTCCGCCTAGA AGCAC，下游引物CGTTGACATCCG TAA AGACC，PCR循環(huán)通過(guò)在95℃下初始變性進(jìn)行5 min，然后在95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min條件下完成35個(gè)循環(huán)，最后72℃ 1 min。

1.4.2CCL5/CXCL4表達(dá)量的檢測(cè) 為了檢測(cè)氫離子處理后心肌缺血小鼠中CCL5-CXCL4異構(gòu)體的表達(dá)水平，在灌注后10 h收獲樣品，在冷裂解緩沖液(10 mmol/L 4-2-羥乙基-1-哌嗪-乙磺酸〔pH 7.9〕，1.5 mmol/L MgCl2，10 mmol/L KCl，1 mmol/L二硫蘇糖醇)和蛋白酶抑制劑混合物(德國(guó)RocheDiagnostics GmbH公司)中輕輕勻漿，然后離心，收集上清液并用于分析。使用二辛可寧酸(美國(guó)Pierce公司)測(cè)量蛋白質(zhì)濃度。將蛋白質(zhì)(36 μg)加載到每個(gè)泳道中，用4%～15%聚丙烯酰胺凝膠(Bio-Rad公司)分離，并電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(美國(guó)MILLIPORE公司)。用含有0.1%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBS)中的5%脫脂奶粉封閉膜1 h，并與1∶250抗小鼠CCL5抗體(美國(guó)R&D Systems Inc公司)一起溫育過(guò)夜。用PBS中的0.1%吐溫洗滌3次，然后在室溫下與1∶1 000二抗(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)一起溫育2 h，并用0.1%Tween的PBS溶液洗滌3次。用ECL試劑(瑞典Amersham Biosciences公司)檢測(cè)信號(hào)。β-肌動(dòng)蛋白用作內(nèi)部對(duì)照。用Image J軟件進(jìn)行條帶的光密度分析。

1.4.3流式細(xì)胞儀統(tǒng)計(jì)白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)目 在灌注后10 h用過(guò)量的異氟烷對(duì)小鼠實(shí)施安樂(lè)死，并用50 ml冷PBS灌注。使用3 ml緩沖液(含有1%胎牛血清的PBS)與3 ml 90%細(xì)胞分離液〔通用電氣(中國(guó))有限公司〕混合在冰上收集他們的心肌細(xì)胞，細(xì)胞懸浮后加入1 ml 70%細(xì)胞分離液，然后將樣品在4℃下以1 500 r/min離心30 min，收集白細(xì)胞并用緩沖液洗滌，然后將細(xì)胞重新懸浮用于統(tǒng)計(jì)。

1.4.4伊文氏藍(lán)/四唑染色法 為了評(píng)估梗死面積的大小，從對(duì)照組和氫離子組(每組10只)中分別切下心臟并用PBS洗滌，灌注200 μl伊文藍(lán)。在-20℃下冷凍1 h后，將心臟切成5個(gè)切片，并在四氮唑溶液中于37℃孵育10 min，然后在10%甲醛中溫育10 min。將切片固定在顯微鏡載玻片之間用于照相和測(cè)量。使用Image J測(cè)量包含藍(lán)色正常區(qū)域，紅色受傷但仍存活區(qū)域和白色梗死區(qū)域的總腦室面積。缺血區(qū)(AAR)計(jì)算為總?cè)旧珔^(qū)域和藍(lán)染區(qū)域之間的差異，并表示為總腦室的百分比梗死面積計(jì)算為白色未染色區(qū)域。

1.4.5超聲心動(dòng)圖 在小動(dòng)物超聲成像儀(日本富士VisualSonics公司)上進(jìn)行二維和M模式超聲心動(dòng)圖測(cè)量。兩種程序均在心肌缺血再灌注后進(jìn)行。用含1.5%異氟烷的面罩麻醉小鼠，并置于溫?zé)釅|上的仰臥位。記錄和分析射血分?jǐn)?shù)，心輸出量，左心室舒張末期(LVEDD)，左心室收縮末期(LVESD)直徑，心率和心臟重量。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1CCL5和CXCL4 mRNA的表達(dá) 與對(duì)照組(0.37±0.01、0.31±0.01)比較，氫離子組CCL5和CXCL4的表達(dá)量顯著降低(0.29±0.01、0.25±0.02；χ2=9.170、7.852，P=0.008、0.015)，說(shuō)明氫離子能夠阻斷CCL5和CXCL4的表達(dá)。見(jiàn)圖1。

圖1 RT-PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)

2.2CXCL4-CCL5異構(gòu)體的表達(dá)量 氫離子組CXCL4-CCL5表達(dá)量(0.29±0.01)顯著低于對(duì)照組(0.37±0.013,t=9.17,P=0.008)，說(shuō)明氫離子能夠降低CXCL4-CCL5異構(gòu)體的表達(dá)，阻止CXCL4-CCL5異二聚體的形成。見(jiàn)圖2。

圖2 CXCL4-CCL5異構(gòu)體蛋白表達(dá)

2.3白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)目 與對(duì)照組〔(19.47±2.13)×104、(33.26±89.74)〕相比，氫離子組中白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)目均顯著下降〔(9.01±2.03)×104、(28.74±85.35)；P<0.05〕，說(shuō)明白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞參與氫離子阻止CXCL4-CCL5異二聚體的形成過(guò)程。

2.4氫離子對(duì)心肌細(xì)胞存活和梗死面積的影響 伊文氏藍(lán)染色顯示氫離子組與對(duì)照組相比梗死面積明顯減小，心肌細(xì)胞存活區(qū)域顯著增多(P<0.01)，見(jiàn)表1、圖3。說(shuō)明氫離子對(duì)心肌缺血有保護(hù)作用。

圖3 心肌細(xì)胞

表1 各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物心肌細(xì)胞存活和梗死面積比較

2.5氫離子對(duì)MI后心功能的影響 與對(duì)照組相比，氫離子組射血分?jǐn)?shù)和心輸出量顯著增加，心率和心臟重量變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，左心室舒張(LVEDD)和收縮(LVESD)末期內(nèi)徑顯著減小，用氫離子治療的心臟沒(méi)有擴(kuò)張，說(shuō)明了氫離子對(duì)MI后的心功能有積極的作用。見(jiàn)表2。

表2 超聲心動(dòng)圖評(píng)估不同處理組心臟功能

3 討 論

MI發(fā)生后，心肌每天從循環(huán)系統(tǒng)招募數(shù)十萬(wàn)白細(xì)胞，骨髓造血系統(tǒng)也迅速啟動(dòng)造血生成，同時(shí)交感神經(jīng)也會(huì)刺激造血祖細(xì)胞遷移至脾臟，產(chǎn)生骨髓外造血，分化出大量白細(xì)胞，進(jìn)一步促進(jìn)炎癥的產(chǎn)生，加重心室重構(gòu)，造成巨大危害。因此，研究MI發(fā)生后對(duì)白細(xì)胞生成的影響，對(duì)抑制MI后炎癥加重有重要的臨床意義。

本研究證明了氫離子能夠特異性阻斷CCL5-CXCL4相互作用，用于治療心肌缺血/再灌注損傷。由于MI后炎癥減少，給予氫離子顯著減少了梗死面積。用氫離子治療后，中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤(rùn)到受影響的心肌區(qū)域減少，這對(duì)梗死結(jié)果和心臟功能產(chǎn)生積極影響。循環(huán)單核細(xì)胞在MI后以不同的波形滲入受影響的組織，經(jīng)典的Ly6Chi CCR2+單核細(xì)胞負(fù)責(zé)清除死細(xì)胞和Ly6Chi CCR2-單核細(xì)胞用于組織修復(fù)，此外，在健康的穩(wěn)態(tài)條件下，心臟組織中充滿了常駐巨噬細(xì)胞。在心臟，肝臟和腦中組織駐留巨噬細(xì)胞起源于胚胎卵黃囊衍生的前體。在穩(wěn)態(tài)條件下，發(fā)現(xiàn)心臟主要由駐留的卵黃囊衍生的巨噬細(xì)胞Ly6Clow CCR2-細(xì)胞填充，其通過(guò)局部增殖自我維持，但各個(gè)趨化因子對(duì)常駐巨噬細(xì)胞的作用尚不明確。本研究觀察到用氫離子處理后心臟單核細(xì)胞含量降低。我們無(wú)法區(qū)分常駐細(xì)胞和浸潤(rùn)細(xì)胞，因?yàn)長(zhǎng)y6Clow CCR2-單核細(xì)胞在急性缺氧事件后發(fā)生在梗死區(qū)域。由于梗死區(qū)域通過(guò)心臟的特殊分布(缺血/再灌注損傷的特征)，氫離子治療后梗死面積的顯著減少允許遠(yuǎn)端心肌補(bǔ)償丟失的組織，從而保持區(qū)域收縮性和心臟功能。心肌具有復(fù)雜的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，除了心肌細(xì)胞外，還包括成纖維細(xì)胞和整合在毛細(xì)血管中的內(nèi)皮細(xì)胞。在缺氧期間，內(nèi)皮細(xì)胞重新組織并開(kāi)始由MI后直接釋放的血管生成因子控制的血管生成，而成纖維細(xì)胞開(kāi)始增殖〔16〕。然而，如本研究中的發(fā)現(xiàn)所示，心肌細(xì)胞正在經(jīng)歷凋亡或甚至壞死。

在所有趨化因子中，趨化因子CCL5在心血管疾病中起特殊作用。CCL5介導(dǎo)單核細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞通過(guò)內(nèi)皮的阻滯和遷移。動(dòng)脈粥樣硬化病變的進(jìn)展是通過(guò)減少梗死后的趨化因子寡聚化〔17〕和心肌損傷，通過(guò)減少受影響心肌細(xì)胞中白細(xì)胞浸潤(rùn)，趨化因子表達(dá)和細(xì)胞凋亡〔13〕。該結(jié)果表明，氫離子對(duì)異構(gòu)體形成的抑制減少了心肌損傷，中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤(rùn)到受影響的組織中的程度與CCL5拮抗劑或阻斷抗體完全抑制相似〔15〕。CXCL4在血小板聚集期間從活化血小板的α-顆粒釋放，并且可以通過(guò)與肝素樣分子結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)血液凝固。CXCL4已被公認(rèn)為巨核細(xì)胞生成和血管生成的生理抑制劑，而不是經(jīng)典的白細(xì)胞募集趨化因子。盡管如此，CXCL4可能會(huì)促進(jìn)炎癥，尤其是心血管疾病。例如，CXCL4的遺傳缺失減少了小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊和新內(nèi)膜形成〔18〕。研究表明，CXCL4可作為平滑肌細(xì)胞的促炎和促有絲分裂因子，促進(jìn)血管損傷后的重塑〔12〕。在急性冠狀動(dòng)脈綜合征期間，患者血清CXCL4水平升高，與心肌損傷的嚴(yán)重程度相關(guān)。在機(jī)制水平上，CXCL4對(duì)CCL5功能的增強(qiáng)似乎主要由CCR1介導(dǎo)，這與CCR1在心肌缺血/再灌注損傷中的作用一致〔8〕。因此，CXCL4似乎在CCL5介導(dǎo)的CCR1激活中起輔助作用，這一功能可能對(duì)CCL5的體內(nèi)活性至關(guān)重要。最近的研究也支持這一觀點(diǎn)，該研究在炎癥性疾病的小鼠模型中實(shí)施了氫離子。例如，氫離子顯示抑制腹主動(dòng)脈瘤的形成和進(jìn)展，減少主動(dòng)脈直徑增大，保留內(nèi)側(cè)彈性蛋白纖維和平滑肌細(xì)胞，并減弱壁畫(huà)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，血管生成和主動(dòng)脈金屬蛋白酶2和9表達(dá)。已知心肌細(xì)胞表達(dá)CCL5，并且向心肌細(xì)胞中添加CCL5顯著降低了肌細(xì)胞的收縮性。由于趨化因子CCL5和CXCL4通過(guò)異構(gòu)化發(fā)揮特定功能，因此通過(guò)氫離子阻斷它不應(yīng)改變這些趨化因子的水平，但它確實(shí)阻斷了異構(gòu)體的功能。 氫離子的處理減少了單核細(xì)胞向缺血細(xì)胞的浸潤(rùn)。