江高飛，暴彥灼，楊天杰，鄭海平，梅新蘭，韋中，徐陽春，沈其榮

（南京農業(yè)大學資源與環(huán)境科學學院/作物免疫重點實驗室/江蘇省固體有機廢棄物資源化高新技術研究重點實驗室/江蘇省有機固體廢棄物資源化協(xié)同創(chuàng)新中心/資源節(jié)約型肥料教育部工程研究中心/國家有機類肥料工程技術研究中心，南京210095）

高溫好氧堆肥是由微生物主導的生物化學過程，是作物秸稈資源化利用的重要方式。木質纖維素在秸稈中含量豐富、結構復雜、微生物可利用性差，嚴重阻礙堆肥化進程[1]，因此加速木質纖維素的降解是提高堆肥效率的關鍵。高溫期（＞55 ℃）是堆肥原料中病原菌、蟲卵和雜草種子滅活的主要階段，也是驅動秸稈腐熟的重要時期[1]。堆肥高溫期的過高溫度會抑制土著微生物的活性，降低堆肥中微生物的豐度和多樣性，甚至導致堆肥活性喪失，從而限制了木質纖維素的降解速度[2-3]，而在堆肥過程中添加耐高溫纖維素分解菌則可以有效彌補這些缺點[4]。因此，篩選分離耐高溫的纖維素分解菌已成為高溫好氧堆肥研究的熱點之一，在提升堆體溫度、堆肥效率與品質等方面具有重要作用。

國內外有關高溫纖維素分解菌篩選的研究較多。吳翔等[5]從稻草堆肥高溫期中分離到1 株可在45 ℃下高效降解纖維素的放線菌Streptomyces sp. CN9。Liu 等[6]從堆肥中篩選到1 株最適分解溫度為50 ℃的纖維素分解真菌Aspergillus fumigatus Z5，其可分泌完整的纖維素酶系，有效降解玉米秸稈。韓如旸等[7]利用纖維素黏附法從高溫堆肥中分離到4 株嗜熱纖維素分解菌，能充分利用濾紙和作物秸稈等富含纖維素的碳源，其最適作用溫度為55～60 ℃。Khelil等[8]從阿爾及利亞西部地區(qū)篩選出16 株嗜熱細菌和3 株嗜熱酵母菌，其能在60 ℃下分泌耐熱纖維素酶，對纖維素具有良好的降解效果。綜上，已有報道的纖維素分解菌耐受溫度大多在65 ℃以下，且部分為厭氧菌，而在實際生產中好氧堆肥高溫期的溫度可達70 ℃以上，此時菌株的活性可能降低甚至休眠，從而導致該階段的纖維素分解速度大幅下降，難以適應生產需求。

為了更好地滿足高溫好氧堆肥實際生產需求，篩選耐高溫，特別是耐75 ℃以上高溫的纖維素分解菌并了解其纖維素酶的熱穩(wěn)定性，對加速高溫好氧堆肥高溫期的腐熟進程具有重要意義。本研究從高溫期堆肥中取樣，并通過連續(xù)高溫富集與馴化，篩選在55～75 ℃下能高效降解纖維素的細菌，以期為耐受高溫期不同高溫程度以及高溫高效降解菌的復配提供理論基礎，為秸稈類農業(yè)廢棄物工廠化堆肥處理提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料

堆肥樣品：高溫時期的堆肥樣品采自某高溫好氧堆肥企業(yè)。

秸稈樣品：水稻秸稈采自南京市江寧區(qū)谷里鎮(zhèn)。用清水將水稻秸稈表面塵土洗凈，晾干，切成2～3 cm的小段，保存?zhèn)溆?。將晾干的水稻秸稈段浸泡?%NaOH 溶液中，80 ℃恒溫水浴20 min，用清水反復沖洗干凈，65 ℃烘干后備用。

1.1.2 培養(yǎng)基

本研究主要采用4 種培養(yǎng)基：富集培養(yǎng)基用于高溫菌初步富集篩選[9]；無機鹽培養(yǎng)基用于高溫菌的復篩[10]；產酶培養(yǎng)基[10-11]和羧甲基纖維素（CMC）-剛果紅培養(yǎng)基[12-13]用于高溫菌降解酶活性的檢測。培養(yǎng)基制備后，置于115 ℃下高壓蒸汽滅菌30 min備用。

1.2 方法

1.2.1 連續(xù)高溫富集培養(yǎng)

稱取1.0 g樣品置于90 mL無菌水的三角瓶中，室溫170 r·min-1振蕩1 h 后靜置30 min。吸取10 mL 上清液加入到90 mL 富集培養(yǎng)基中，分別置于55、65、75 ℃下170 r·min-1振蕩培養(yǎng)。每隔72 h 取10%（V/V）轉接至新的富集培養(yǎng)基中培養(yǎng)，連續(xù)富集馴化5 次。將選取的各處理富集培養(yǎng)液用8 層無菌紗布過濾，濾液用于分離對應溫度下富集獲得的秸稈降解菌。

1.2.2 高溫降解菌的初篩

將55、65、75 ℃的富集培養(yǎng)液用無菌水梯度稀釋后，在CMC-剛果紅培養(yǎng)基平板上均勻涂布，分別置于對應篩選溫度下恒溫培養(yǎng)48 h，挑選有水解圈的菌株分離純化。將純化后的菌株在富集培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，各菌株菌懸液OD600調整至0.1。在CMC-剛果紅培養(yǎng)基平板中心接種10 μL 菌懸液，分別置于對應篩選溫度下恒溫培養(yǎng)48 h，測定水解圈直徑（D）和菌落直徑（d），計算水解圈直徑與菌落直徑比（D/d），直徑比大表示菌株水解CMC 的能力強。每株菌株3次重復。

1.2.3 高溫降解菌的復篩

通過菌株對水稻秸稈的相對降解率，復篩獲得高溫秸稈高效降解菌：接種10%（V/V）過夜培養(yǎng)的初篩菌株，在富集培養(yǎng)基中培養(yǎng)6～8 h 至對數期備用（OD600=0.5～0.6）。接種1%（V/V）對數期菌液150 mL到產酶培養(yǎng)基（±3.00 g 水稻秸稈條），分別置于55、65 ℃和75 ℃、170 r·min-1恒溫培養(yǎng)7 d 后，獲得不同降解程度的秸稈殘渣。復篩主要通過秸稈相對降解率和纖維素酶活兩個評價指標篩選。

1.2.4 秸稈相對降解率RDE的計算

在秸稈降解試驗結束后，將不同處理得到的秸稈殘渣從三角瓶倒入平板中，并用無菌水洗凈三角瓶中秸稈殘渣，以降低誤差，然后65 ℃烘干8 h 至恒質量，再從平板中取出烘干秸稈稱質量。計算秸稈相對降解率RDE：RDE（%）=（W0-W）/W0×100%，其中W0為對照秸稈殘渣干質量，W為高溫菌降解的秸稈殘渣干質量。相對降解率高表示高溫菌降解水稻秸稈的效果好，每株菌3次重復。

1.2.5 不同溫度下菌株降解水稻秸稈效果的研究

參考1.2.4 中高溫菌處理水稻秸稈相對降解率的檢測方法，分別探究55、65 ℃和75 ℃高溫下不同菌株對水稻秸稈降解效果的差異，以篩選不同高溫下具備高效降解水稻秸稈能力的菌株。

1.2.6 纖維素酶活的測定

粗酶液的制備：參照1.2.3 的方法制備對數期菌懸液接種，按照1%（V/V）接種量接種至100 mL 無機鹽培養(yǎng)基（1% 水稻秸稈粉）中，75 ℃高溫、170 r·min-1恒溫培養(yǎng)7 d。取發(fā)酵液10 000 r·min-1離心5 min 收集上清液，即得粗酶液，用于濾紙酶活的測定。

濾紙酶活與CMC 酶活測定：采用DNS 比色法[13]。將1 min 內水解生成1 μmol 還原糖所需的酶量定義為一個活力單位（U）。

外切葡聚糖酶與β-葡萄糖苷酶酶活測定：參照Parry 等[14]的方法。將1 min 內水解生成1 μmol 對硝基苯酚所需的酶量定義為一個活力單位（U）。

1.2.7 菌株鑒定

采用OMEGA 細菌基因組提取試劑盒提取菌株總DNA，具體過程參見說明書。以細菌通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′ 和1492R：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT- 3′ 對16S rRNA進行PCR 擴增，擴增產物送往上海生物工程有限公司測序。將16S rRNA 基因的測序結果在NCBI 數據庫（https：//ncbi.nlm.nih.gov/）中BLAST比對分析，選相似性＞99.5% 的序列在MEGA7 軟件基于Neighbor-Joining 法構建系統(tǒng)發(fā)育樹（https：//www.megasoftware.net）。

1.2.8 數據分析

所有結果采用R 4.0 版本（https：//www.r-project.org）分別進行數據處理和統(tǒng)計分析，通過tidyverse、reshape2 和tidyr 包進行數據轉化處理，采用stats 和ggpubr 包進行統(tǒng)計分析，利用ggplot2 進行數據可視化，為了更好地顯示數據分布，對縱坐標進行了平方根轉化。統(tǒng)計分析主要采用單因素方差分析（ANOVA）、雙因素方差分析（Two-way ANOVA）、最小顯著性差異法配對比較（LSD檢驗），顯著性水平為0.05。

2 結果與分析

2.1 高溫降解菌的分離與篩選

通過連續(xù)5 次高溫馴化獲得13 株具備分解纖維素能力的耐高溫細菌：55 ℃分離到6 株（B-1～B-6），65 ℃分離到4 株（B-7～B-10），75 ℃分離到3 株（B-11～B-13）。水解圈試驗結果表明，不同溫度下分離菌株的纖維素分解能力存在顯著差異，即在CMC-剛果紅培養(yǎng)基上水解圈與菌落直徑比不同（D/d，圖1A）：55、65 ℃和75 ℃分離菌株的D/d范圍分別是3.67～6.30（F5，12=5.5，P=0.007 4）、3.21～5.08（F3，8=17.1，P=0.000 7）和2.19～5.25（F2，6=7.0，P=0.026 7；ANOVA）。其中，55 ℃下B-1、B-5和B-6的纖維素分解能力差異不顯著（P＞0.05），其中B-5 最強，且顯著高于B-2、B-3 和B-4（P＜0.05），B-2、B-3 和B-4 處理間差異不顯著（P＞0.05）；65 ℃下B-7的纖維素分解能力顯著高于B-8和B-10（P＜0.01），B-9最差；75 ℃下B-11的纖維素分解能力最高，B-13 最低，B-12 的纖維素分解能力介于兩者之間且差異不顯著（P＞0.05，LSD檢驗）。

水稻秸稈降解實驗表明，不同溫度下的分離菌株對水稻秸稈的相對降解率（RDE）差異顯著（圖1B）：55、65 ℃和75 ℃分離菌株的RDE 范圍分別是4.58%～16.61%（F5，12=733.4，P＜0.000 1）、12.08%～20.84%（F3，8=381.8，P＜0.000 1）和1.81%～9.44%（F2，6=1 394，P＜0.000 1；ANOVA）。其中，55 ℃下B-2、B-5和B-6 的CMC 分解能力差異不顯著（P＞0.05），B-1較 弱（P＜0.01），B-3 次 之（P＜0.001），B-4 最 差（P＜0.001）；65 ℃ 下B-7 的CMC 分 解 能 力 最 強（P＜0.05），B-8、B-9 和B-10 的CMC 分解能力差異不顯著（P＞0.05）；75 ℃下B-11 的CMC 分解能力最強，B-12次之，B-13最差（P＜0.01，LSD 檢驗）。結合水解圈和水稻秸稈降解試驗篩選出不同高溫情況下，纖維素分解能力和秸稈降解能力較強的耐高溫細菌4株，即選取55 ℃分離菌株B-5 和B-6、65 ℃分離菌株B-7 以及75 ℃分離菌株B-11 作為候選菌株，用于后續(xù)研究。

2.2 高溫高效降解菌的篩選

圖1 耐高溫分離菌株水解圈及其水稻秸稈降解能力Figure 1 Hydrolytic zone and rice straw degrading ability of thermophilic bacterial isolates

將上述4 株候選耐高溫細菌分別在55、65 ℃和75 ℃條件下培養(yǎng)，模擬考察堆肥高溫期不同潛在高溫水平對候選菌株降解水稻秸稈能力的影響。如圖2A所示，候選菌株對水稻秸稈的降解能力受菌株類型（F3，24=17.3，P＜0.000 1）和溫度（F2，24=273.7，P＜0.000 1）的影響很大，其中溫度為降解能力變異的主要來源（解釋水平為72.67%），且與菌株類型之間存在顯著交互響應（F2，24=21.6，P＜0.000 1，Two-way ANOVA）。候選菌株在55 ℃（F3，8=160.9，P＜0.000 1）和75 ℃（F3，8=56.2，P＜0.000 1）時對水稻秸稈的RDE 存在顯著差異，在65 ℃時（F3，8=3.8，P=0.057 4）的差異不顯著（ANOVA）：55 ℃下候選菌株的RDE 范圍是14.48%～19.47%，B-7 對水稻秸稈的降解能力最強（P＜0.05），B-5 和B-6 次之（P＞0.05），B-11 較弱（P＜0.01）；65 ℃下的RDE 范圍是10.87%～15.68%，不同菌株對水稻秸稈的降解能力差異不顯著（P＞0.05）；75 ℃下的RDE 范圍是1.20%～9.33%，其降解能力的強弱順序為B-11＞B-7＞B-5和B-6（LSD檢驗）。

候選菌株降解水稻秸稈的能力與溫度的變化呈負相關關系，即相對降解效率隨著溫度的升高而降低（圖2A）。與55 ℃相比，65 ℃下B-6 對水稻秸稈RDE的降幅最大（25.23%），B - 6 次之（19.47%），B - 5（8.71%）和B-11 的RDE 降幅最?。?.31%）；75 ℃下B-11 對水稻秸稈RDE 的降幅最?。?8.63%），而其他候選菌株的降幅均超過67%，降幅最大的是B-6（92.37%）。75 ℃下候選菌株對水稻秸稈的降解效果如圖2B所示。比較不同溫度下候選菌株對水稻秸稈降解能力的影響發(fā)現，B-7 在55 ℃和65 ℃高溫下表現較好，在75 ℃高溫下降解能力較差。B-11 盡管在55 ℃和65 ℃時降解效果較弱，但溫度耐受性較強，尤其在75 ℃的高溫下依然保持較高的水稻秸稈降解能力，因此將B-7 和B-11 確定為目標高溫高效降解菌株，用于后續(xù)研究。

2.3 高溫高效秸稈降解菌纖維素酶的熱穩(wěn)定性

圖2 候選菌株在不同溫度下的相對降解率和75 ℃下的降解效果Figure 2 Relative degradation efficiency at different temperatures and degradation effect at 75 ℃of candidate strains

圖3 菌株B-7和B-11的4種纖維素酶的熱穩(wěn)定性Figure 3 Thermostability of four cellulases in strain B-7 and B-11

分別測定了B-7 和B-11 分泌的濾紙酶（FPase）、纖維素內切酶（CMCase）、外切葡聚糖酶（EGLase）和β-葡萄糖苷酶（BGLase）在55～90 ℃范圍內相對酶活的變化規(guī)律，以此表征與木質纖維素降解過程相關的酶的熱穩(wěn)定性。如圖3 所示，兩株高溫高效秸稈降解菌的4 種纖維素酶活性隨著溫度的升高總體呈先升高后降低的趨勢。雙因素方差分析發(fā)現，各纖維素酶對溫度變化的響應存在顯著差異（F1，50=12.11～14.84，P＜0.001），且與菌株存在顯著的交換效應（F1，50=5.27～14.31，P＜0.05），溫度對酶活性變異的影響（解釋水平為50.91%～70.50%）高于交互作用（解釋水平為29.50%～49.09%）。B-7 的4 種纖維素酶在50～60 ℃范圍內隨溫度的升高活性增強，超過60 ℃時活力急劇下降，最適溫度均在60 ℃左右。B-11 的4 種纖維素酶在50～80 ℃范圍內隨著溫度的升高而活性增強，濾紙酶、纖維素內切酶和外切葡聚糖酶的最適溫度為75 ℃，β-葡萄糖苷酶則在75～80 ℃之間，超過最適溫度后各酶活迅速下降。兩株高溫高效降解菌在高溫好氧堆肥中具有一定的應用價值：B-7 在50～65 ℃范圍各纖維素酶的活性較高（P＜0.05），而B-11 在75～80 ℃范圍各纖維素酶的活力更好（LSD 檢驗，P＜0.05）。

2.4 高溫高效秸稈降解菌的分子鑒定

16S rRNA 序列比對分析和系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現兩株目標菌株與芽孢桿菌科的革蘭氏陽性菌高度相似（圖4）。菌株B-7 與芽孢桿菌屬纖維素芽孢桿菌（B.cellulasensis）、平流層芽孢桿菌（B.stratosphericus）、嗜氣芽孢桿菌（B.aerophilus）、高海拔芽孢桿菌（B.altitudinis）和短小芽孢桿菌（B. pumilus）的相似性大于99.5%。菌株B-11 與地芽孢桿菌屬立陶宛地芽孢桿菌（Geobacillus lituanicus）、好熱地芽孢桿菌（G. kaustophilus）、嗜熱脂肪芽孢桿菌（G. stearothermophilus）的相似性大于99.5%。系統(tǒng)發(fā)育分析結果表明，芽孢桿菌屬和地芽孢桿菌屬的細菌明顯形成兩個分支。菌株B-7與短小芽孢桿菌的系統(tǒng)發(fā)育距離最近，因此命名為短小芽孢桿菌B-7（Bacillus pumilusB-7）。菌株B-11 與嗜熱脂肪芽孢桿菌的系統(tǒng)發(fā)育距離最近，因此命名為嗜熱脂肪芽孢桿菌B-11（Geobacillus stearothermophilusB-11）。

3 討論

高溫好氧堆肥的堆體溫度在70 ℃以上，超高溫好氧堆肥的堆體溫度一般在80 ℃以上[15]。在該溫度下，堆體中多數微生物已經休眠或死亡，篩選適應高溫的降解菌對高溫好氧堆肥具有重要意義。本研究通過高溫馴化篩選得到兩株能高效降解秸稈的高溫降解菌：短小芽孢桿菌B-7 和嗜熱脂肪芽孢桿菌B-11，其中B-7 在55～65 ℃高溫下活性較高，B-11 在75 ℃時效果更好，其纖維素降解相關酶熱穩(wěn)定性強，75～80 ℃依然保持較高活性，表明菌株B-11 可以在75 ℃以上高溫時相對降解率下降不明顯，且其產酶穩(wěn)定性相對較高。短小芽孢桿菌和嗜熱脂肪芽孢桿菌均屬于芽孢桿菌科的革蘭氏陽性細菌，對溫度的耐受性較強，是常見的嗜熱菌[16]。有研究表明，短小芽孢桿菌可降解玉米秸稈[17]、蠶沙[18]和牦牛糞便[19]等廢棄物中的纖維素，甚至可以降解硝磺草酮等農藥殘留物[20-21]，應用十分廣泛[16]。盡管有報道研究堆肥場周圍土壤[22]和堆肥樣品中[23]的短小芽孢桿菌分離株對堆肥中纖維素的降解能力，但并未深入解析其在不同溫度對降解效果的影響。本研究發(fā)現短小芽孢桿菌4種纖維素降解相關酶的適宜溫度在60 ℃左右，且熱穩(wěn)定性好，這與其55～65 ℃下對秸稈高效降解能力相符。

圖4 16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育分析鑒定菌株B-7和B-11Figure 4 Phylogeny analysis of 16S rRNA sequences for identification of strain B-7 and B-11

嗜熱脂肪芽孢桿菌最早于1917 年由荷蘭學者在118 ℃滅菌75 min 的棉花秸稈中分離得到，其與芽孢桿菌形態(tài)相似，適宜生長溫度為60～65 ℃，因此被命名為Bacillus stearothermophilus[24]。由于芽孢桿菌屬諸多成員間的表型和16S rRNA 序列差異巨大，日本學者于2001 年將Bacillus stearothermophilus等rRNA第五群的成員從芽孢桿菌屬中分離出來，命名為地芽孢桿菌屬（Geobacillus）[25]。地芽孢桿菌屬多數成員表型更為相似，不僅具有嗜熱和兼性厭氧特征，還能降解有害物質，在油田和火山口這些高溫極端環(huán)境中生存能力強[26]。國外學者從糖廠廢水[27]、溫泉[28]和棕櫚油場[29]等地篩選并研究了地芽孢桿菌在60 ℃高溫下的纖維素等降解酶的活力，然而我國與之相關研究并不深入，特別是在堆肥過程中地芽孢桿菌的降解效果和耐高溫機理方面。程旭艷等[30]從雞糞鋸末好氧堆肥樣品中分離得一株地芽孢桿菌HN-5，其纖維素酶活性高，能夠促進堆體升溫，延長高溫期持續(xù)時間。此外嗜熱脂肪地芽孢桿菌在60～70 ℃范圍內，能促進屠宰廠廢棄物好氧堆肥的腐熟進程，改善堆體理化性質，溫度超過70 ℃會導致堆體理化性質異常，影響堆肥進程[31]。相比之下，本研究篩選的嗜熱脂肪地芽孢桿菌B-11，其耐熱性更強，在75～80 ℃甚至85 ℃下仍保持較高的纖維素酶活力，水稻秸稈降解效果遠超其他菌株，包括本研究篩選的耐高溫短小芽孢桿菌B-7。

4 結論

本研究篩選的兩株高溫高效降解菌B-7 和B-11具有良好的溫度適應性，其秸稈降解能力和纖維素酶活在65～80 ℃之間表現優(yōu)異，最適溫度分別為55～65 ℃和75 ℃。