Pycnoporus sp.SYBC-L3漆酶催化偶氮染料脫色

王 琦，徐楚涵，竇 欣，管政兵，蔡宇杰，廖祥儒*

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫214122）

關(guān)鍵字：Pycnoporus sp.SYBC-L3；漆酶；偶氮染料；漆酶脫色

目前世界上有10 000多種染料，被廣泛地應(yīng)用于紡織、造紙、皮革、化妝品等行業(yè)，每年的使用量超過(guò)70萬(wàn)t[1]。按照化學(xué)結(jié)構(gòu)，可將染料分為偶氮染料、蒽醌染料、三芳甲烷染料，雜環(huán)染料等。偶氮染料是偶氮基兩端連接芳基的一類(lèi)有機(jī)化合物，占全球染料市場(chǎng)的比例超過(guò)50%，廣泛用于多種天然和合成纖維的染色和印花[2]。染色過(guò)程中約有10%的染料未被利用而隨著廢水排出[3]，偶氮染料廢水的排放不僅會(huì)影響水體色澤、透明度、溶氧量等，還具有高致癌性和致畸性，如果未經(jīng)處理直接排出，會(huì)對(duì)生態(tài)系統(tǒng)和人類(lèi)的健康造成嚴(yán)重的威脅[4]。雖然很多物理化學(xué)方法能起到較好的脫色效果，例如活性炭吸附、電凝聚、沉淀、絮凝、膜過(guò)濾、反向滲透、臭氧氧化法、離子交換處理法等，但成本高、能耗大、潛在二次污染的風(fēng)險(xiǎn)等缺陷限制了其實(shí)際應(yīng)用[5]。因此，探究對(duì)印染廢水中偶氮染料高效、快速、經(jīng)濟(jì)的降解方法有重要的意義。其中，利用生物降解法尤其是利用漆酶降解染料因其經(jīng)濟(jì)性及環(huán)境友好等特點(diǎn)而得到廣泛關(guān)注[6]。

漆酶（Laccase，E.C.1.10.3.2）是一種含銅的多酚氧化酶，可催化氧化酚類(lèi)、芳胺、羧酸等化合物及其衍生物，在小分子介體的協(xié)助下，漆酶的底物進(jìn)一步擴(kuò)大[7]，其在紙漿漂白、環(huán)境激素降解、印染廢水處理、木材預(yù)處理等領(lǐng)域展現(xiàn)出較好的應(yīng)用潛力[8-9]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)開(kāi)展了利用漆酶進(jìn)行染料脫色的研究，漆酶來(lái)源涉及Ganoderma lucidum[10]、Ganoderma weberianum[11]、Trametes versicolor[12]、Trametes trogii[13]、Pycnoporus sanguineus[14]、Bacillus pumilus[15]、Lepista nuda[16]、Cerrena unicolor[17]等。Pycnoporus sp.SYBC-L3是作者所在實(shí)驗(yàn)室篩選出的優(yōu)良菌株，漆酶產(chǎn)量高，發(fā)酵周期較短，其所產(chǎn)漆酶Lac-L有較好的pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性[18]。不同來(lái)源的漆酶有不同的酶學(xué)特性與底物范圍，其對(duì)染料的脫色條件及脫色效率也不盡相同[10-17，19]，因此有必要對(duì)Pycnoporus sp.SYBC-L3所產(chǎn)漆酶Lac-L的染料脫色應(yīng)用開(kāi)展針對(duì)性研究，進(jìn)而探討Lac-L在工業(yè)染料處理中的應(yīng)用前景。

本文作者利用Lac-L降解酸性紅1（AR1）、活性黑5（RB5）、活性紫5R（RV5R）3種偶氮染料，考察介體、溫度、pH等因素對(duì)脫色反應(yīng)的影響；根據(jù)脫色前后的染料溶液對(duì)小麥和水稻種子發(fā)芽的影響，評(píng)估脫色前后染料的植物毒性變化，為L(zhǎng)ac-L在偶氮染料廢水脫色方面的進(jìn)一步研究及工業(yè)應(yīng)用提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種Pycnoporus sp.SYBC-L3為作者所在實(shí)驗(yàn)室篩選到的漆酶高產(chǎn)菌株，PDA固體斜面保藏。

1.1.2 試劑活性黑5、酸性紅1、活性紫5R，染料化學(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)表1，購(gòu)自Sigma公司；麥芽糖、一水檸檬 酸、CuSO4·5H2O、MnSO4·H2O、KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；2'-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）、1-羥基苯并三唑（HBT）、2，2，6，6-四甲基哌啶氧化物（TEMPO）、2，6-二甲氧基苯酚（DMP）、乙酰丁香酮（AS）、香草醛（VAN）、丁香醛（SYR），購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；漆酶Lac-L為Pycnoporus sp.SYBC-L3發(fā)酵液經(jīng)純化所得[18]。

1.1.3 儀器與設(shè)備紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：759S上海棱光技術(shù)有限公司產(chǎn)品；THZ-82A水浴恒溫振蕩器：蘇州威爾實(shí)驗(yàn)用品有限公司產(chǎn)品；CP313電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司產(chǎn)品；TGL-16M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司產(chǎn)品；SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品；STARTER 3100 pH分析計(jì)：奧豪斯儀器（上海）有限公司產(chǎn)品；AKTA avant蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)：美國(guó)通用公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 漆酶酶活測(cè)定以ABTS為底物測(cè)定漆酶酶活，參照黃亮等[20]的測(cè)定方法并略做調(diào)整。反應(yīng)體系為（3 mL）：2.4 mL 0.1 mol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH 3）、0.5 mL的1 mmol/L ABTS及0.1 mL的粗酶液。加入酶液之后在420 nm處測(cè)吸光值（ε=36 000 L/（mol·cm））。1個(gè)酶活力單位定義為：每分鐘氧化1μmol的ABTS所需要的酶量。

表1 3種偶氮染料的化學(xué)性質(zhì)Table 1 Chemical characteristics of three azo dyes

1.2.2 偶氮染料脫色反應(yīng)及脫色率的計(jì)算脫色實(shí)驗(yàn)初始反應(yīng)體系：反應(yīng)體系總體積10 mL，染料質(zhì)量濃度50 mg/L，漆酶活性1 U/L，氧化還原介體濃度50μmol/L（ABTS和DMP濃度為10μmol/L），體系pH值為4.0（20 mmol/L Na2HPO4-檸檬酸緩沖液），反應(yīng)溫度30℃。反應(yīng)期間定時(shí)取樣，

于各染料最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定反應(yīng)液的吸光度Ae。以反應(yīng)體系中加入等量滅活漆酶作為對(duì)照組，于各染料最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定反應(yīng)液的吸光度Ac，按照以下公式計(jì)算脫色率：

1.2.3 反應(yīng)體系中各參數(shù)對(duì)染料脫色的影響實(shí)驗(yàn)中分別改變反應(yīng)體系中緩沖液的pH值（3.0～8.0）、反應(yīng)溫度30～70℃和添加的小分子介體種類(lèi)、染料質(zhì)量濃度及酶用量，測(cè)定在不同反應(yīng)條件下的脫色率，考察反應(yīng)體系中上述參數(shù)對(duì)染料脫色的影響。

1.2.4 染料及其降解產(chǎn)物對(duì)作物發(fā)芽的研究將20粒小麥或水稻種子均勻地撒在鋪有干凈濾紙的9 cm平板中，每24小時(shí)添加5 mL未降解染料溶液、漆酶降解后的染料溶液和蒸餾水（對(duì)照），置于30℃恒溫培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)3 d后，測(cè)定發(fā)芽率、胚芽長(zhǎng)度和根長(zhǎng)度。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。采用OriginLab Origin V8.5軟件對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行分析及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 介體對(duì)脫色的影響

為了找到最佳的介體，作者探究了7種介體對(duì)偶氮染料脫色率的影響（見(jiàn)圖1）。不添加介體（CK）的情況下漆酶對(duì)偶氮染料的脫色率為0，表明偶氮染料不是Lac-L的直接底物，Tavares等[21]和Zeng等[22]也發(fā)現(xiàn)漆酶不可催化偶氮染料降解，而李松等報(bào)道了Trametes sp.LS-10C漆酶無(wú)須介體參與就可以降解偶氮染料，但無(wú)介體時(shí)脫色效率較低，添加介體后脫色效率顯著提高。在添加介體的情況下，3種偶氮染料都有不同程度的降解。以DMP為介體時(shí)效果最差，利用HBT、ABTS、AS、SYR 4種介體，漆酶對(duì)偶氮染料都有較好的脫色效果，其中以HBT為介體時(shí)脫色效率最高。Khlifi[23]等發(fā)現(xiàn)HBT為T(mén)rametes trogii漆酶催化染料脫色的最佳介體，而來(lái)源于Aspergillus sp.的漆酶以ABTS為介體時(shí)對(duì)RB5脫色效果最好，以HBT、TEMPO、VAN為介體時(shí)脫色效率較低[21]，王天女[24]考察了酵母表達(dá)的重組血紅密孔菌漆酶對(duì)RB5的脫色能力，研究中發(fā)現(xiàn)VAN是促進(jìn)RB5脫色的最佳介體，而以AS為介體時(shí)脫色效果較差。因此，不同來(lái)源的漆酶在催化染料脫色時(shí)不同介體的催化效率存在一定的差異。

圖1 介體對(duì)染料脫色的影響Fig.1 Effect of redox mediators on decolorization of dyes

2.2 溫度對(duì)染料脫色的影響

反應(yīng)溫度是影響酶催化效率的重要因素，在一定溫度范圍內(nèi)，染料脫色率隨著溫度的升高而升高，當(dāng)溫度升高到70℃時(shí)，3種染料的脫色率均有所下降，可能與高溫導(dǎo)致漆酶失活有關(guān)。在40～60℃的溫度范圍內(nèi)，3種染料均有較好的脫色率，50℃時(shí)脫色率最高（見(jiàn)圖2）。

圖2 溫度對(duì)染料脫色的影響Fig.2 Effect of temperature on decoloration of dyes

以漆法降解染料的研究中，SUKALacc[25]在反應(yīng)溫度大于35℃后脫色效率逐漸下降，Ganoderma lucidum U-281漆酶在溫度大于40℃后，脫色效率迅速降低，可能由于其熱穩(wěn)定性較差，因而在較高溫度下酶失活的速率快而導(dǎo)致染料的脫色率降低；在以菌體降解染料的研究中，Karunya等[26]報(bào)道了利用Moraxella osloensis降解偶氮染料，最適溫度為35℃，當(dāng)溫度達(dá)到50℃時(shí)，脫色效率大大降低，反應(yīng)48 h后的脫色率僅有24%，石貝杰[27]利用云芝降解偶氮染料，當(dāng)溫度大于28℃時(shí)，脫色效率隨著溫度的升高而迅速下降。在印染工序中，需要45℃以上熱水的工序占整個(gè)工序的90%左右，60℃和90℃以上的分別占整個(gè)工序的45%和10%左右，因此印染廢水的溫度較高[28]，在印染廢水處理的實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)該考慮到酶或菌體的耐熱性。相比較而言，Pycnoporus sp.SYBC-L3漆酶Lac-L的反應(yīng)溫度高，熱穩(wěn)定性較好[18]。因此，在工業(yè)化印染廢水處理中有一定的應(yīng)用前景。

2.3 pH對(duì)染料脫色的影響

反應(yīng)體系的pH是影響酶反應(yīng)速率的另一個(gè)關(guān)鍵因素。AR1和RV5R在pH值為4.0時(shí)脫色率最高，而RB5的最適反應(yīng)pH值為5.0。隨著pH的增高，3種染料的脫色率先升高后下降，在中性和堿性條件下，AR1和RV5R僅有不到5%的脫色率，RB5在pH值為8時(shí)也僅有6.4%的脫色率（見(jiàn)圖3）。在Zeng[29]、Ashrafi[30]和Forootanfar[31]等的研究中，漆酶在pH值在3～5時(shí)對(duì)染料的脫色率較高，之后隨著pH的升高脫色率逐漸下降，本論文中pH對(duì)脫色率的影響與之相似。因此，在印染廢水脫色處理過(guò)程中，為了提高脫色效率，需適當(dāng)調(diào)節(jié)原水的pH到酸性范圍。

圖3 pH值對(duì)染料脫色的影響Fig.3 Effect of pH on decoloration of dyes

2.4 漆酶用量對(duì)脫色率的影響

反應(yīng)體系中漆酶活力從0.1 U/mL上升至1 U/mL時(shí)，3種染料的脫色率隨著漆酶活力的升高而升高，當(dāng)漆酶活力大于1 U/mL時(shí)，脫色率無(wú)明顯升高（見(jiàn)圖4）。趙世光等[10]利用漆酶降解偶氮染料，酶用量為2 U/mL，Murugesan等[32]的酶用量為2.5 U/mL，而李松等[33]的漆酶用量達(dá)到了10 U/mL。在實(shí)際處理染料廢水時(shí)要考慮到成本問(wèn)題，酶用量越多其越成本越高，應(yīng)該在充分考慮脫色率的基礎(chǔ)上減少酶消耗量，提高染料降解方法的經(jīng)濟(jì)性。

圖4 漆酶用量對(duì)染料脫色的影響Fig.4 Effects of laccase dosage on decolorization of dyes

2.5 染料質(zhì)量濃度對(duì)脫色率的影響

當(dāng)染料質(zhì)量濃度分別在10～30 mg/L（AR1）、10～50 mg/L（RB5）、20～50 mg/L（RV5R）的 范圍 內(nèi)時(shí)，漆酶對(duì)3種染料的脫色率最高，后續(xù)實(shí)驗(yàn)染料質(zhì)量濃度分別選用30 mg/L（AR1）、50 mg/L（RB5、RV5R）（見(jiàn)圖5）。不同的染料，其質(zhì)量濃度變化對(duì)脫色率的影響不同，隨著染料質(zhì)量濃度升高，AR1的脫色率下降最快，當(dāng)染料質(zhì)量濃度增加到100 mg/L時(shí)，與最高脫色率相比，3種染料的脫色率分別下降了43.4%（AR1）、14.3%（RB5）、10.5%（RV5R）。染料質(zhì)量濃度對(duì)脫色反應(yīng)存在一定的影響，Claus[34]、Ramirez[35]、Sayahi[13]等的報(bào)道中也存在類(lèi)似的情況。

圖5 染料質(zhì)量濃度對(duì)染料脫色的影響Fig.5 Effects of dye concentration on decolorization of dyes

2.6 最優(yōu)條件下脫色率隨時(shí)間變化趨勢(shì)

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在最佳脫色反應(yīng)條件下，連續(xù)脫色一段時(shí)間，期間定時(shí)取樣測(cè)定吸光度，觀察脫色反應(yīng)中脫色率隨時(shí)間的變化規(guī)律，結(jié)果如圖6所示。結(jié)果表明，漆酶對(duì)3種偶氮染料的脫色率隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，但是脫色速率逐漸減慢。AR1和RV5R幾乎完全降解，其脫色率分別為96.1%（AR1）和97.8%（RV5R），而RB5的最大脫色率為83.8%。不同染料的降解速度不同，AR1在2.5 h即脫色完畢，而RB5和RV5R達(dá)到最大脫色率需要5 h。

圖6 脫色率隨時(shí)間變化趨勢(shì)Fig.6 Change of decolorization rate of dyes with time

在染料脫色處理中，脫色時(shí)間和脫色率是整體評(píng)價(jià)脫色效率的2個(gè)重要指標(biāo)。Zhou等[15]使用固定化的芽孢桿菌漆酶處理AR1，48 h后脫色率僅有69.7%。趙世光等[10]采用Ganoderma lucidum粗漆酶處理直接橙S脫色，1.5 h脫色率為63.0%，此后隨著脫色時(shí)間的延長(zhǎng)，脫色率沒(méi)有明顯的上升。Yadav等[36]以重組漆酶催化降解臺(tái)盼藍(lán)36 h，脫色率達(dá)到91.7%。Trametes versicolor漆酶在固定和游離狀態(tài)下對(duì)酸性橙的脫色率（6 h）分別為39%和63%，在添加外源介體ABTS的情況下，脫色率均上升到73%[37]。綜合對(duì)比以上研究，本研究中密孔菌漆酶Lac-L對(duì)3種偶氮染料的脫色時(shí)間相對(duì)較短、脫色率較高，因此該漆酶具有較好的應(yīng)用前景。

2.7 偶氮染料脫色前后吸收?qǐng)D譜變化

分別對(duì)脫色前后的染料溶液、HBT和漆酶-HBT反應(yīng)液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果如圖7所示。結(jié)果顯示，與對(duì)照樣品相比，3種偶氮染料在其最大吸收波長(zhǎng)處的吸收峰均有明顯的降低，其中AR1和RV5R的吸收峰幾乎完全消失，RB5在597 nm處仍有一定的吸光值，這與之前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同。酶降解后的AR1的光譜圖上出現(xiàn)了新的吸收峰，與未降解染料的最大吸收峰相比，該峰的最大吸收波長(zhǎng)變短且吸光值顯著降低，曾祥康[38]在毛栓菌漆酶對(duì)AR1降解中也觀察到了新的吸收峰的出現(xiàn)，王志新[39]采用HPLC方法觀察到漆酶降解AR1后有新物質(zhì)的出現(xiàn)。

圖7 染料溶液AR1、RB5、RV5R經(jīng)漆酶催化脫色前后吸收?qǐng)D譜變化Fig.7 Absorption spectrograms of AR1，RB5，RV5R solutions before and after decoloration catalyzed by laccase

2.8 偶氮染料降解前后對(duì)作物發(fā)芽的研究

為了使染料廢水得到處理，除了需要去除其中的顏色外，還得保證脫色后的產(chǎn)物沒(méi)有毒性才能將其排放。對(duì)偶氮染料及其酶解產(chǎn)物進(jìn)行小麥和水稻種子的生態(tài)毒理實(shí)驗(yàn)（見(jiàn)表2—3），結(jié)果顯示，利用偶氮染料灌溉小麥和水稻種子，其發(fā)芽率顯著降低，小麥發(fā)芽率僅有57.6%～71.7%，水稻發(fā)芽率為73.3%～81.7%，而染料降解后對(duì)種子發(fā)芽的影響大大降低，小麥和水稻發(fā)芽率均達(dá)到90%以上，對(duì)發(fā)芽率無(wú)明顯的抑制作用。使用未降解的染料灌溉小麥種子后，根和胚芽的生長(zhǎng)受到強(qiáng)烈的抑制作用，對(duì)胚芽抑制率在20%～25%，對(duì)根生長(zhǎng)抑制率在50%以上，染料降解后對(duì)根和胚芽生長(zhǎng)的抑制顯著降低，但仍存在一定的抑制作用，對(duì)胚芽生長(zhǎng)的抑制率不到10%，對(duì)根生長(zhǎng)的抑制率在24.5%～32.0%。與對(duì)照相比，偶氮染料對(duì)水稻種子芽生長(zhǎng)的抑制率接近30%，對(duì)水稻根生長(zhǎng)的抑制率均超過(guò)60%，而染料降解后對(duì)芽和根生長(zhǎng)的脅迫有所減弱，但對(duì)其生長(zhǎng)仍有一定的影響。

表2 偶氮染料降解前后對(duì)小麥發(fā)芽的影響Table 2 Effect of azo dyes before and after degradations on wheat germination

表3 偶氮染料降解前后對(duì)水稻發(fā)芽的影響Table 3 Effect of azo dyes before and after degradations on rice germination

偶氮染料降解前后對(duì)其他物種的毒性變化也有報(bào)道，Ghodake等[40]的研究表明，染料降解后對(duì)高粱和菜豆的發(fā)芽不存在抑制作用，對(duì)根和芽生長(zhǎng)的抑制率也顯著降低；Ashrafi等[30]報(bào)道了偶氮染料降解后對(duì)微生物 （E.coli、P.aeruginosa、S.typhi、B.subtilis、S.aureus、M.luteus）的毒性顯著降低。因此利用漆酶降解偶氮染料不僅具有脫色作用，還有一定的脫毒作用。

3 結(jié)語(yǔ)

以Pycnoporus sp.SYBC-L3所產(chǎn)漆酶Lac-L對(duì)3種偶氮染料進(jìn)行脫色，通過(guò)對(duì)介體、反應(yīng)溫度、pH、染料質(zhì)量濃度、酶用量這些因素逐個(gè)考察后，得到最佳脫色條件：采用HBT為介體、50℃、pH分別為4.0（AR1，RV5R）和5.0（RB5）、染料質(zhì)量濃度分別為30 mg/L（AR1）和50 mg/L（RB5、RV5R）、漆酶用量1 U/mL。在該條件下，AR1脫色2.5 h達(dá)到最大脫色率96.1%，RB5和RV5R在5 h分別達(dá)到最大脫色率83.8%和97.8%。Lac-L催化3種偶氮染料脫色的效果良好，時(shí)間相對(duì)較短，并且能夠在較高的溫度下進(jìn)行脫色反應(yīng)，具有一定的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。

工業(yè)廢水排放后有可能被用于灌溉田地。脫色前染料對(duì)種子發(fā)芽率、根和胚芽的生長(zhǎng)有顯著的抑制作用，可見(jiàn)未經(jīng)處理的染料廢水不可用于農(nóng)田灌溉，而降解后的染料廢水對(duì)小麥和水稻發(fā)芽率沒(méi)有影響，對(duì)根和胚芽生長(zhǎng)的影響也大大降低，說(shuō)明其毒性有所降低。在偶氮染料廢水處理中，除了顏色的脫去外，也需要關(guān)注有機(jī)物的降解及毒性的變化。染料脫色后產(chǎn)生的是何種降解產(chǎn)物，這些產(chǎn)物對(duì)不同的動(dòng)物、植物、微生物是否有毒性，仍需要開(kāi)展深入研究。