索玉娟 林 婷 瞿 洋 白亞龍 沈源源 邵 毅 周昌艷*

（1 上海農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標準與檢測技術研究所 上海201403 2 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估實驗室（上海） 上海201403 3 上海農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全工程技術研究中心 上海201403）

單核細胞增生李斯特菌 （Listeria monocytogenes）是一種常見的食源性致病菌，可引起人和動物的李氏桿菌?。↙isteriosis）。該病發(fā)病率雖不高，但致死率可達20%～40%，在世界范圍內(nèi)引起高度關注，并被世界衛(wèi)生組織列為五大食源性病原菌之一[1-2]。

單核細胞增生李斯特菌是革蘭氏陽性兼性厭氧菌，在自然界分布廣泛，水、土壤、植物腐爛部分、動物糞便及廢水中均有該菌存在[3]。自1926年首次分離到單核細胞增生李斯特菌后，由該菌引起的李氏桿菌病已引起多例食源性疫情[4]。例如，2011年，美國28 個州暴發(fā)香瓜遭該菌污染疫情，147 人患病，33 人死亡[5]。2014年9月，丹麥38 人因為食用被該菌污染的香腸、肉卷等患病，至少造成15 人死亡[6]。在我國，由于飲食習慣的差異，加之流行病學統(tǒng)計數(shù)據(jù)的不完善，尚未大規(guī)模李氏桿菌病爆發(fā)的報道。個別研究者統(tǒng)計了2002—2012年全國27 個省市李氏桿菌病數(shù)據(jù)，11年間共有84 人患病，表明該菌在我國的致病風險仍不容忽視[7]。

單核細胞增生李斯特菌的致病性與不同類型的菌株有關，不同亞型菌株的致病力存在較大差異[8]。目前普遍認為該菌的致病性與菌株的血清型關系密切，其中對人致病的血清型主要為4b，1/2a，1/2b 和1/2c（約占由該菌引起病例的95%），血清型4b 多見于李氏桿菌病的流行暴發(fā)中，1/2a 和1/2b 血清型多見于零星感染的病例中[4，8]。探討不同來源單核細胞增生李斯特菌的污染特征并進一步對其流行病學加以描述，是致病菌溯源、防控中重要的監(jiān)測內(nèi)容。本研究采集了上海市9 大區(qū)的四大類（肉、蛋、奶和果蔬）食用農(nóng)產(chǎn)品，對其中的單核細胞增生李斯特菌進行分離、鑒定，并對收集的分離株進行血清組分型，為識別該菌的流行菌株在農(nóng)產(chǎn)品中的分布及風險提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

2016年4月～2017年5月共采集樣品437份。除51 份生鮮牛奶由上海市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心提供外，其余386 份樣品分別采自上海市9 個區(qū)（金山區(qū)、奉賢區(qū)、閔行區(qū)、徐匯區(qū)、寶山區(qū)、嘉定區(qū)、松江區(qū)、青浦區(qū)和浦東新區(qū)）的各大超市、農(nóng)貿(mào)市場及部分區(qū)域的生產(chǎn)基地。

1.2 培養(yǎng)基與試劑

李斯特氏菌增菌液（LB）、吖啶黃素（C1，C2）、萘啶酮酸（C1，C2）、科瑪嘉李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基、單增李斯特菌生化鑒定試劑盒，北京陸橋技術有限責任公司；腦心浸出液肉湯（BHI，Oxoid），上海博蘊生物科技有限公司；2×Taq PCR Master-Mix、2K DNA Marker、細菌DNA 提取試劑盒、瓊脂糖，北京全式金生物技術有限公司；PCR 引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 主要儀器和設備

PCR 儀（Mastercycler nexus GSX1）、臺 式 高速冷凍離心機（Centrifuge 5424R），德國Eppendorf公司；凝膠成像分析系統(tǒng)（FR-980A）、核酸電泳儀（Sub-cell GT），美國Bio-rad 公司；高壓滅菌鍋（SX-500），日本TOMY 公司；生物安全柜（1300 series A2），美國Thermo scientific 公司；恒溫培養(yǎng)箱（DNP-9272 型），上海精宏設備有限公司；恒溫振蕩培養(yǎng)箱（TQZ-312 型），上海精宏實驗設備有限公司；Nano Drop（2000C），美國Thermo scientific 公司；電子天平（AL104），Mettler Toledo。

1.4 試驗方法

1.4.1 分離鑒定方法 根據(jù)國標GB 4789.30-2010 《食品安全國家標準食品微生物學檢驗單核細胞增生李斯特氏菌檢驗》[9]規(guī)定方法進行檢測；疑似菌株用菌落PCR 擴增hly 基因再驗證，具體如下：

20 μL PCR 體系：2×Taq PCR Master Mix 10 μL、上下引物（hly）各0.8 μL，加ddH2O 補足，無菌操作挑入單增李斯特菌疑似菌落為模板進行菌落PCR。反應條件：95 ℃預變性10 min，接著35 個循環(huán)，每循環(huán)包括95 ℃30 s，55 ℃30 s 退火，72 ℃30 s 延伸，循環(huán)結束后，72 ℃8 min；PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。用于菌株鑒定的引物序列見表1。

1.4.2 DNA 提取 菌株DNA 模板的制備參照細菌DNA 提取試劑盒說明書的方法操作。

1.4.3 多重PCR 血清分型 參考Doumith 等[10]PCR 血清方法略做修改，50 μL PCR 體系含有：2×Taq PCR Master Mix 25 μL，10 μmol/L 的引物（lmo0737，lmo1118，ORF2819，ORF2110，prs 分別為3.5，3.5，3.5，5，0.7 μL），100 ng/μL 的模板2 μL，補水至50 μL；反應程序：94 ℃預變性5 min，接著35 個循環(huán)，每個循環(huán)包括94 ℃24 s，55 ℃69 s，72 ℃69 s，循環(huán)結束后，72 ℃7 min；PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。用于血清分型的引物lmo0737，lmo1118，ORF2819，ORF2110，prs序列見表1。

1.4.4 統(tǒng)計分析 本研究使用SPSS 統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進行卡方檢驗分析，當P<0.05 時表示數(shù)據(jù)之間具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 單核細胞增生李斯特菌在農(nóng)產(chǎn)品的污染狀況

對采集的4 大類9 種食用農(nóng)產(chǎn)品樣品進行單核細胞增生李斯特菌的分離鑒定，結果見表2。437 份樣品中共有59 份樣品檢出單核細胞增生李斯特菌，篩選得到79 株分離株。4 大類樣品中均有目的菌檢出，其中生鮮肉的檢出率最高，平均為26.8%（56/209）；生牛奶與生雞蛋較低分別為2.0%（1/50）和1.9%（1/54）；鮮食果蔬最低為1.0%（1/104）。

生鮮肉中，生雞肉的污染最為嚴重（45.6%），其次為生牛肉、生豬肉和生羊肉，這3 類樣品污染狀況比較接近，均在20%～23%之間；生雞蛋中2份樣品陽性；生菜和生牛奶中各有一份樣品為陽性。

2.2 不同來源樣品中單核細胞增生李斯特菌的分布

將樣品按照不同來源進行分類，單核細胞增生李斯特菌在不同來源、不同類別中的檢出率如表3所示，流通環(huán)節(jié)的超市和農(nóng)貿(mào)市場檢出率明顯偏高；除基地來源的生牛奶有少量檢出外，其它基地來源的生豬肉和果蔬均無該菌檢出。

表2 不同農(nóng)產(chǎn)品樣品中單核細胞增生李斯特菌的污染情況Table 2 Distribution of L.monocytogenes in different agri-food samples

表3 單核細胞增生李斯特菌在不同來源樣品中的污染狀況Table 3 Prevalence of L.monocytogenes in samples from different sampling site

2.3 不同季節(jié)單核細胞增生李斯特菌的分布

本研究中單核細胞增生李斯特菌的檢出率隨著季節(jié)的變化也有不同（表4）。其中4 個季節(jié)的檢出率分別是：春季16.0%、夏季29.6%、秋季8.5%、冬季13.3%，夏季單核細胞增生李斯特菌檢出率要顯著高于春秋冬3 季（春夏、夏秋、夏冬的P 值分別為0.018，0.001 和0.014），春、秋、冬3 季之間的檢出率無顯著性差異（P>0.05）。

表4 不同季節(jié)中單核細胞增生李斯特菌的分布情況Table 4 The prevalence of L.monocytogenes in different seasons

2.4 單核細胞增生李斯特菌血清分型

多重PCR 血清分型的部分結果見圖1，共有5 種帶型：泳道1 擴增出370 bp 和691 bp 片段，對應血清組（1/2a，3a）；泳道2 擴增出370 bp 和470 bp 片段，對應血清組（1/2b，3b，7）；泳道3 擴增出370，691 bp 和906 bp 片段，對應血清組（1/2c，3c）；泳道4 擴增出370，471 bp 和597 bp 片段，對應血清組（4b，4d，4c）；泳道12 只擴增出370 bp 片段，對應血清組（4a，4c）。

79 株單核細胞增生李斯特菌被分為5 個血清組：44 株（53.0%）屬于血清組1/2a 或3a；17 株（20.5%）屬于血清組1/2c 或3c；14 株（16.9%）屬于血清組1/2b 或3b 或7，3 株（7.2%）屬于血清組4a 或4c；1 株（2.4%）屬于血清組4b 或4d 或4e。不同農(nóng)產(chǎn)品來源的單核細胞增生李斯特菌血清組分布詳見表4。7 種農(nóng)產(chǎn)品的分離株血清組都以1/2a 或3a 為主，該血清組菌株在7 種農(nóng)產(chǎn)品中的占比為45.5%～100%，1/2c 或3c 占比為16.7%～31.8%，1/2b 或3b 或7 占比為6.7%～27.3%，4a 或4c 占比為3.3%～7.7%，4b 或4d 或4c 來源于超市生牛肉樣品。

圖1 部分單核細胞增生李斯特菌多重PCR 血清分型結果Fig.1 Multiplex-PCR amplification patterns of selected L.monocytogenes isolates

表5 79 株單核細胞增生李斯特菌農(nóng)產(chǎn)品分離株的血清組分布Table 5 Distribution of serogroups among 79 L.monocytogenes isolates obtained from different types of produce

3 討論

農(nóng)產(chǎn)品是食源性致病菌傳播的主要載體，加強農(nóng)產(chǎn)品中單核細胞增生李斯特菌的風險監(jiān)測，對保障整個飲食框架的安全將起到積極作用。本研究調(diào)查了上海市9 大區(qū)437 份農(nóng)產(chǎn)品中單核細胞增生李斯特菌的污染狀況，并對這些樣品來源的分離株進行了血清組分型，為上海地區(qū)單核細胞增生李斯特菌流行病學的風險監(jiān)測提供了數(shù)據(jù)支持。

4 大類農(nóng)產(chǎn)品（肉、蛋、奶和果蔬）中生鮮肉的污染最為嚴重，這與已有報道一致[11-13]，而生肉的總體污染率為27.2%（61/224） 較高于已有的部分研究結果。王文凱[14]在2013—2014年間對上海市場的94 份生肉樣品進行檢測，單核細胞增生李斯特菌的檢出率為16.0%；Wu 等[15]在2012—2014年間對全國24 個省市的196 份生肉樣品進行檢測，單核細胞增生李斯特菌的檢出率為20.9%。這些差異除與微生物分布的不確定性有關外，也與樣品采集的地點存在很大關系[16]。本研究涵蓋了上海市9 大區(qū)域的超市、農(nóng)貿(mào)市場和部分區(qū)域基地的農(nóng)產(chǎn)品樣品，每區(qū)域至少進行2 次重復樣品采集，較全面地反應了上海市農(nóng)產(chǎn)品中單核細胞增生李斯特菌的污染狀況。

3 類采樣地點——超市、農(nóng)貿(mào)市場和基地的樣品中，超市樣品的總體污染率（21.4%）稍高于農(nóng)貿(mào)市場（15.4%）。此外，本研究中除牛肉外，超市中采集的農(nóng)產(chǎn)品類別其陽性率也高于農(nóng)貿(mào)市場樣品類別。有學者認為單核細胞增生李斯特菌能在4℃下生長，大多數(shù)細菌在此低溫環(huán)境中生長受到抑制，使前者形成競爭優(yōu)勢而易于污染樣品[17-18]。超市的畜禽肉常置于冷柜，農(nóng)貿(mào)市場通常為常溫放置，環(huán)境溫度的差異可能導致污染率不同。同時，農(nóng)產(chǎn)品從生產(chǎn)、貯運到銷售任何一個環(huán)節(jié)都存在被致病菌污染的風險，各環(huán)節(jié)的衛(wèi)生規(guī)范也是影響該菌分布的重要影響因素[19]。此外，本研究對上海部分基地生產(chǎn)的生豬肉、果蔬和生牛乳進行污染排查，除1 份生牛乳中檢出目的菌外，均未在生產(chǎn)（種植）環(huán)節(jié)的農(nóng)產(chǎn)品中發(fā)現(xiàn)該菌。流通環(huán)節(jié)中畜禽肉的高污染狀況需進一步溯源分析，以確定重點防控環(huán)節(jié)。

單核細胞增生李斯特菌的污染率還受到季節(jié)的影響。本研究持續(xù)監(jiān)測的1年期間，該菌在夏季污染率顯著高于春秋兩季，一般認為夏季高溫適于細菌的生長繁殖，許多研究也呈現(xiàn)出致病菌夏季高污染率的趨勢[20-22]。而本研究中秋季的低污染率可能與樣品采集數(shù)量與種類的不均一性有關。雖然本研究對每個季節(jié)、每種樣品都有涉及，但并沒有對某一地點、某種樣品進行針對性的季節(jié)影響調(diào)查，故本研究結果只能反應季節(jié)影響的大致趨勢。

多重PCR 血清組分型克服了傳統(tǒng)血清凝集試驗對試劑、操作等要求高的缺點，避免了交叉反應出現(xiàn)的誤判，是單核細胞增生李斯特菌血清分型中廣泛采用的快速分析方法[23]。本研究得到的79 株分離株包含了目前該方法所含有的全部5個血清組：（1/2a 或3a），（1/2c 或3c），（1/2b 或3b或7），（4a 或4c），（4b 或4d 或4e）。由于3a，3c，3b，7，4d，4e 在食品和臨床上極為罕見，故屬于血清組（1/2a 或3a）、（1/2c 或3c）、（1/2b 或3b 或7）、（4b 或4d 或4e） 的菌株一般可認為是1/2a，1/2c，1/2b 和4b 血清型[24-25]。按照上述理論及臨床統(tǒng)計信息，本研究從農(nóng)產(chǎn)品中分離得到的單核細胞增生李斯特菌多為容易引起零星感染的疑似1/2a和1/2b 血清型，從生牛肉中分離得到的疑似4b血清型為流行病學暴發(fā)常見血清型，其余血清型在臨床上引起的病例較不常見。

綜上所述，上海9 個地區(qū)437 份農(nóng)產(chǎn)品（肉、蛋、奶和果蔬）中，畜禽肉是單核細胞增生李斯特菌的主要載體，從這些載體中分離得到的79 株單核細胞增生李斯特菌可分為多種血清型，并存在較高致病風險，這些結果為單核細胞增生李斯特菌的風險監(jiān)測提供了數(shù)據(jù)支撐。