郭 楊，陳立新，姜海鵬，戰(zhàn)宇航

（1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士后科研工作站，哈爾濱 150086；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝分院，哈爾濱 150069；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030）

大豆胞囊線蟲?。⊿oybean cyst nematode，SCN）是由大豆胞囊線蟲（Heterodera glycinesIchinohe）引起的世界性大豆病害，給大豆生產(chǎn)造成毀滅性損失[1]。SCN分布廣、危害重、其休眠體（胞囊）存活時間長，是一種極難防治的土傳性病害。SCN可被劃分為多個生理小種，不同生理小種分布和致病程度不同，在我國大豆主產(chǎn)區(qū)1號、3號、4號生理小種分布最廣、出現(xiàn)頻率最高，其中4號生理小種致病力最強(qiáng)[2]。主要有輪作倒茬、化學(xué)藥劑、生物防治、合理施肥等防治措施，但效果不理想。選育和利用抗病品種是比較經(jīng)濟(jì)、安全、有效的控制SCN方法[3]。目前，國際上使用最多的SCN抗源為PI88788和Peking（PI548402），但過度使用有限抗源已導(dǎo)致SCN群體轉(zhuǎn)移，失去對SCN的抗性[4]。因此，培育新SCN抗源對大豆生產(chǎn)發(fā)展具有重要作用。

常規(guī)育種由于周期長，優(yōu)良性狀和不良性狀緊密連鎖，不易選育出具有多種優(yōu)良性狀的大豆抗性品種。隨著分子生物學(xué)快速發(fā)展，通過基因工程和分子育種技術(shù)發(fā)掘和利用大豆胞囊線蟲抗性基因，已成為常規(guī)育種外極具潛力的培育抗胞囊線蟲大豆品種方法[5]。

SCN是一種受多基因控制的復(fù)雜數(shù)量性狀[6]。Cook等研究表明rhg1位點抗性由串聯(lián)排列的具有色氨酸/絡(luò)氨酸透性酶結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)運子、SNAP蛋白和具有創(chuàng)傷誘導(dǎo)蛋白結(jié)構(gòu)域的蛋白等3個基因拷貝數(shù)共同決定[7]。Liu等研究表明Rhg4位點抗性由絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶（Serine hydroxyl methyltransferase，GmSHMT）決定，抗病品種和感病品種SHMT編碼區(qū)內(nèi)單核苷酸突變（SNP）使SHMT酶底物結(jié)合位點氨基酸不同，致使成熟蛋白在催化性狀方面表現(xiàn)差異，影響合胞體內(nèi)葉酸平衡，最終造成合胞體細(xì)胞環(huán)境改變導(dǎo)致線蟲死亡[8]。除rhg1和Rhg4位點外，Lin等研究表明水楊酸合成代謝及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中GmSAMT基因發(fā)揮重要作用，在大豆根中表達(dá)顯著提高SCN抗性[9]。目前為止，這些抗性基因僅解釋部分抗源中SCN抗性，所以挖掘新抗病基因?qū)CN抗性育種及解析SCN抗性機(jī)制具有重要意義。

磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白（Phosphatidyl ethanolamine-binding protein，PEBP）基因家族在植物、真菌、昆蟲和人類中廣泛存在。該基因家族在植物成花轉(zhuǎn)變、種子發(fā)育和萌發(fā)中發(fā)揮重要作用。目前，已在擬南芥、水稻、玉米和大豆等多種植物中分離較多PEBP基因[10]。通過研究PEBP基因家族功能發(fā)現(xiàn)，PEBP蛋白在植物體內(nèi)參與MAPK/ERK信號通路調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、遷移和黏附，NFKB信號通路調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，GPCR信號通路調(diào)控G蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多個胞內(nèi)信號通路[11]。目前PEBP功能研究主要集中在哺乳動物及模式作物擬南芥，大豆研究報道較少。轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)廣泛應(yīng)用于大豆胞囊線蟲病抗性基因篩選[12]。所以本研究利用抗病材料東農(nóng)L-10轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，選取在大豆胞囊線蟲4號生理小種脅迫后差異表達(dá)的磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白（PEBP）基因，命名為Gm-PEBP4-1。利用RT-PCR技術(shù)克隆抗病候選基因GmPEBP4-1，在生物信息學(xué)基礎(chǔ)上利用qRT-PCR技術(shù)分析該基因在抗、感SCN病材料中基因表達(dá)量。初步探討GmPEBP4-1基因在大豆胞囊線蟲脅迫后響應(yīng)，以期為SCN抗性育種提供抗病基因資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與處理

抗大豆胞囊線蟲病材料“東農(nóng)L-10”、“東農(nóng)L-204”、“Kangxian2”和感病材料“黑農(nóng)37”、“ 綏農(nóng)14”、“綏農(nóng)10”種子取自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院大豆生物學(xué)教育部重點實驗室。大豆胞囊線蟲4號生理小種（HG type 1.2.3.5.7）采自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所試驗田，經(jīng)Riggs和Schmitt鑒別模式[13]，鑒定結(jié)果為大豆胞囊線蟲4號生理小種。

將東農(nóng)L-10種子在蛭石+草炭土（1∶1）中萌發(fā)，萌發(fā)后移栽至裝滿蒸氣殺菌砂盆中。將苗期幼苗放入生長室水桶。大豆在自然光周期生長室中培養(yǎng)，采用隨機(jī)完全區(qū)組設(shè)計，3個重復(fù)，每個重復(fù)10株。每株幼苗接種約2 000條幼蟲（J2）。分別于接種后0、7 d隨機(jī)選擇SCN接種的根，酸性品紅染色，以確認(rèn)感染成功。采集接種成功根樣，用于轉(zhuǎn)錄組測序。

選取尺寸一致抗大豆胞囊線蟲病材料和感病材料種子種于蛭石+草炭土（1∶1）中，在溫室中（28℃/25℃、16 h光照/8 h黑暗、相對濕度70%）培養(yǎng)至苗期，幼苗接種約2 000條幼蟲（J2），酸性品紅染色，以確認(rèn)感染成功。分別于接種后0、3、7、10 d隨機(jī)選擇3株SCN接種和未接種大豆根樣，用于基因表達(dá)分析。

1.2 大豆總RNA提取和cDNA合成

采用Trizol法提取大豆根系總RNA，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。Nanovue超微量紫外分光光度計檢測純度及濃度。使用SYBR Prime-Script RT-PCR Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄提取RNA，得到cDNA。

1.3 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

將cDNA送往北京華大測序公司作RNA-Seq分析。使用Illumina HiSeq2000平臺產(chǎn)生用于從頭組裝的100 bp成對末端序列讀物。在Illumina HiSeq 2000平臺上，采用50 bp單端讀數(shù)對文庫測序，作RNA-Seq分析。根據(jù)基因處理前后表達(dá)量，篩選脅迫后明顯上調(diào)基因。

1.4 基因克隆

通過在線程序Phytozome（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）查找GmPEBP4-1基因序列，利用Primer primier 5.0軟件設(shè)計特異引物，引物為GmPEBP4-1F：AGAACACGGGGGACTATGTCTAGGCTCATGGAACC

GmPEBP4-1R：ATCCTCTGTTTCTAGTCACCT CCTTCTTGCAGCAG，以東農(nóng)L-10 cDNA為模板作特異性擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系20 μL，DNA模板1 μL、10×PCR butter 2 μL、2.5 mmol·L-1dNTP mix 0.2 μL、引物 F 0.5 μL、引物 R 0.5 μL、Taq酶0.3 μL、ddH2O 15.5 μL。PCR反應(yīng)程序為：預(yù)變性94℃，5 min；變性94℃，10 s；退火60℃，30 s；延伸溫度：72℃，30 s，共36個循環(huán)，4℃保存。將所擴(kuò)增片段連接pMD18-T載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5ɑ，挑取陽性克隆送至北京華大公司測序，利用DNAMAN軟件比對測序結(jié)果。

1.5 生物信息學(xué)分析

利用在線程序ProtParam（http://web.expasy.org/prot-param/）分析GmPEBP4-1蛋白理化性質(zhì)；利用在線軟件ExPASy-ProtScale（http://www.Expasy.org/tools/protscale.html）預(yù)測編碼蛋白疏水性/親水性；利用在線軟件NCBI CDD（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/docs/cdd_search.html）分析蛋白結(jié)構(gòu)域；利用在線程序SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）預(yù)測蛋白二級結(jié)構(gòu)；利用MEGA7軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，采取遺傳距離建樹相鄰連接法；通過大豆基因數(shù)據(jù)庫Phtozome（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html），選取候選基因上游2 000 bp分析啟動子，并在Plant CARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在線分析軟件上分析基因啟動子順式作用元件。

1.6 GmPEBP4-1基因表達(dá)分析

GmPEBP4-1基因序列，利用Primer primier 5.0軟件設(shè)計實時熒光定量PCR引物，引物為F：TTCGATCCCTTCACTTTGC，R：AGGACTTGGAGCATC TGGG。內(nèi)參基因選取大豆管家基因Actin 4，引物序列為Actin 4F：GTTTCAAGCTCTTGCTCGTAATCA，Actin 4R：GTGTCAGCCATACTGTCCCCATTT。應(yīng)用Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System（Life technologies，USA），以4個時間點處理和對照根系cDNA為模板，作qRT-PCR擴(kuò)增。熒光反應(yīng)體系參照SYBR?Select Master Mix試劑盒（TaKaRa）說明書，PCR反應(yīng)體系20 μL，Green Premix Ex TaqTMII（2×）10 μL，上游引物（10 ng·mL-1）0.8 μL，下游引物（10 ng·mL-1）0.8 μL，，模板2 μL， ddH2O 6.4 μL。 反 應(yīng)程 序 ：95 ℃ 30 s，95℃3 s，60℃30 s，72℃30 s，40個循環(huán)。采用2-ΔΔCT法計算基因相對表達(dá)量[14]，設(shè)置3次獨立技術(shù)重復(fù)和3次生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 GmPEBP4-1基因序列克隆及生物信息學(xué)分析

選取在蛭石中培養(yǎng)15 d后東農(nóng)L-10根部組織提取總RNA，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，18S和28S帶型清晰（見圖1），無明顯降解，利用Nanovue超微量紫外分光光度計檢測提取RNA，OD260/280均在1.96～2.1，表明提取RNA完整性好，純度較高，可用于反轉(zhuǎn)錄。

以反轉(zhuǎn)錄后cDNA為模板，利用GmPEBP4-1克隆引物對其作PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖2，GmPEBP4-1基因擴(kuò)增片段長度為500 bp左右，與預(yù)期519 bp一致，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序比對，結(jié)果見圖3，與參考序列相同，證明PCR擴(kuò)增結(jié)果正確。

通過ExPASy-ProParam分析GmPEBP4-1（Glycine max Wm82.a2.v1）基因序列編碼蛋白質(zhì)理化性質(zhì)，結(jié)果表明，GmPEBP4-1編碼172個氨基酸，ExPASy-ProParam蛋白分子質(zhì)量為19.34 ku，原子總數(shù)為2 716個，化學(xué)式為C854H1358N246O249S9，不穩(wěn)定指數(shù)（Instability index，II）52.58（大于40.0），是一種不穩(wěn)定蛋白，脂肪系數(shù)76.98，總平均親水性-0.337。進(jìn)一步分析氨基酸組分顯示（見圖4），精氨酸（Arg）、脯氨酸（Pro）和纈氨酸（Val）占比最高，等電點為9.16，含有19個負(fù)電荷氨基酸殘基（Asp+Glu）和22個正電荷氨基酸殘基（Arg+Lys），預(yù)測為酸性蛋白。通過在線工具ExPASy-ProScale預(yù)測分析編碼蛋白疏水性（見圖5），GmPEBP4-1蛋白在126-149位氨基酸有最強(qiáng)親水性，其在第141位處有最強(qiáng)親水峰值-3.189；在第14-29位氨基酸區(qū)域有較強(qiáng)疏水性，其中第155處有最大疏水性峰值1.911。親水性氨基酸多于疏水性氨基酸，屬于親水性蛋白。通過NCBI CDD（Conserved Protein Domain Family）分析GmPEBP4-1蛋白保守結(jié)構(gòu)域（見圖6），該基因保守結(jié)構(gòu)域為磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白（PEBP，PF01161）結(jié)構(gòu)域，存在8個底物結(jié)合位點。對該基因蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測得到其TM螺旋長度主要存在4種結(jié)構(gòu)（見圖7），分別為16.28% α-螺旋（Alpha helix，Hh）、25.58%延伸鏈結(jié)構(gòu)（Extended strand，E）、4.07%β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)（Beta turn）及54.07%無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)（Random coil）。從NCBI數(shù)據(jù)庫中選取與大豆GmPEBP4-1蛋白相似性較高的8種蛋白氨基酸序列，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，根據(jù)不同物種親緣遠(yuǎn)近可分為兩組（見圖8），大豆（Glycine max）、相思子（Abrus precatorius）、胡桃（Juglans regia）、樹棉（Gossypium arboreum）、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）、番木瓜（Carica papaya）、菜豆（Phaseolus vulgaris）聚為一組，擬南芥（Arabidopsis thaliala）、長蒴黃麻（Corchorus olitorius）聚為一組。兩個分組中，大豆GmPEBP4-1蛋白與相思子PEBP蛋白親緣性最高。

從大豆基因組數(shù)據(jù)庫（Phytozome）中搜索到GmPEBP4-1基因序列，截取ATG上游2 000 bp序列，輸入Plant CARE在線分析系統(tǒng)中分析啟動子發(fā)現(xiàn)，該基因上游存在35種順式作用元件，其中CGTCA-motif、TGACG-motif為控制茉莉酸甲酯（MEJA）順式作用元件，在響應(yīng)生物和非生物脅迫中發(fā)揮重要作用；TCT-rich repeats，P-box和ABRE為應(yīng)激、脅迫響應(yīng)相關(guān)元件（見圖9），推測該基因可感知逆境脅迫并參與抗逆變化。

2.2 GmPEBP4-1基因表達(dá)分析

為進(jìn)一步驗證大豆GmPEBP4-1基因是否在抗病過程中發(fā)揮作用，在大豆胞囊線蟲4號生理小種侵染不同階段，利用qRT-PCR分析該基因在抗病材料東農(nóng)L-10、東農(nóng)L-204、Kangxian2和感病材料黑農(nóng)37、綏農(nóng)14、綏農(nóng)10表達(dá)量。由圖10可知，抗病品種在大豆胞囊線蟲脅迫后3、7、10 d，GmPEBP4-1基因表達(dá)量較對照均顯著提高，表現(xiàn)先升后降趨勢，并在7 d時表達(dá)量最高。在感病品種黑農(nóng)37中，大豆胞囊線蟲脅迫7 d時GmPEBP4-1基因表達(dá)量最高，3和10 d時Gm-PEBP4-1基因表達(dá)量較對照變化不顯著。由結(jié)果可知，GmPEBP4-1基因在大豆胞囊線蟲4號生理小種脅迫過程存在響應(yīng)，但在抗病品種和感病品種中基因表達(dá)模式存在差異。

3 討論與結(jié)論

本研究利用抗病材料東農(nóng)L-10轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，篩選出受大豆胞囊線蟲4號生理小種脅迫差異表達(dá)基因GmPEBP4-1。利用RT-PCR技術(shù)成功克隆GmPEBP4-1基因，經(jīng)生物信息學(xué)軟件分析發(fā)現(xiàn)，該基因CDS序列全長519 bp，編碼172個氨基酸，是一種親水性蛋白。氨基酸組分中精氨酸（Arg）、脯氨酸（Pro）和纈氨酸（Val）占比最高；等電點為9.16，初步預(yù)測為酸性蛋白。其編碼的蛋白質(zhì)含有無規(guī)則卷曲（54.07%）、延伸鏈（25.58%）、α-螺旋（16.28%）和β-轉(zhuǎn)角（4.07%）。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，大豆GmPEBP4-1蛋白與相思子PEBP蛋白同源性最高，親緣性最近。GmPEBP4-1蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析顯示含有保守PEBP（PF01161）結(jié)構(gòu)域，與張禮鳳等[15]大豆PEBP基因家族均具有保守PEBP結(jié)構(gòu)域研究結(jié)果一致。

啟動子順式作用元件為同一DNA分子中具有特殊功能的轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合位點和其他調(diào)控基序，在基因轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控中發(fā)揮重要作用；本研究通過PlantCARE在線預(yù)測軟件分析GmPEBP4-1基因上游2 000 bp序列啟動子元件，發(fā)現(xiàn)該基因上游存在（TCT-rich repeats，P-box、ABRE）與應(yīng)激、脅迫相關(guān)元件。表明該基因可感知逆境脅迫并參與抗逆變化，與劉瑞芬等磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白基因與小麥抗寒能力研究結(jié)果一致[16]。同時在該基因啟動子中還發(fā)現(xiàn)（CGTCA-motif、TGACG-motif）控制茉莉酸甲酯（MEJA）順式作用元件，表明利用葉面噴施茉莉酸有效降低線蟲在易感番茄中繁殖能力，提高防御能力[17]；在茉莉酸處理條件下，可提高溫度敏感的抗線蟲基因在高溫處理下抗性[18]；大豆防御SCN侵染反應(yīng)中，茉莉酸部分合成途徑在植物防御系統(tǒng)中表現(xiàn)為上調(diào)[19]；在大豆中過表達(dá)參與茉莉酸類JA/JA-Ile途徑3個擬南芥基因（AtAOS、AtAOC和AtJAR），提高其SCN抗性[9]。在水稻抗根結(jié)線蟲研究中發(fā)現(xiàn)，外施茉莉酸甲酯（MeJA）導(dǎo)致線蟲跟植物互作活力降低，植物抗性增強(qiáng)[20]；這些結(jié)果說明茉莉酸作為一種內(nèi)源生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，參與抗線蟲反應(yīng)。因此，存在茉莉酸甲酯（MEJA）順式作用元件的GmPEBP4-1基因可能在抗大豆胞囊線蟲反應(yīng)中發(fā)揮作用。

當(dāng)植物受外界脅迫時，防衛(wèi)基因可被多種因子誘導(dǎo)，引起新基因表達(dá)和原有基因活化，抵御外界脅迫[21]。本研究中，在大豆胞囊線蟲4號生理小種脅迫下，利用qRT-PCR分析抗病品種東農(nóng)L-10、東農(nóng)L204、Kangxian2和感病品種黑農(nóng)37、綏農(nóng)14、綏農(nóng)10中GmPEBP4-1基因表達(dá)量，結(jié)果表明GmPEBP4-1基因在大豆胞囊線蟲4號生理小種脅迫下存在響應(yīng)，并在抗感品種中表達(dá)量存在顯著差異。東農(nóng)L-10、東農(nóng)L-204和Kangxian2不但具有大豆胞囊線蟲4號生理小種抗性，也具有大豆胞囊線蟲3號生理小種抗性，所以推測Gm-PEBP4-1基因可能對大豆胞囊線蟲3號生理小種存在響應(yīng)。Klink等研究表明SCN在侵染大豆后8 d左右開始建立合胞體[22]，本研究中抗病品種和感病品種GmPEBP4-1基因表達(dá)量均在7 d達(dá)到最大值，表明該基因可能在大豆胞囊線蟲大豆體內(nèi)建立合胞體時發(fā)揮重要作用。

本研究初步確定GmPEBP4-1基因響應(yīng)大豆胞囊線蟲4號生理小種，預(yù)測GmPEBP4-1基因生物信息學(xué)功能，但GmPEBP4-1基因在大豆中是否提高SCN抗性以及具體功能有待進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果為進(jìn)一步探究GmPEBP4-1基因功能及其參與大豆胞囊線蟲病基因相關(guān)分子機(jī)制奠定理論依據(jù)。