陳銳，高賀，張國軍，朱克巖，成衛(wèi)寧

（1西北農(nóng)林科技大學植物保護學院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西北黃土高原作物有害生物綜合治理重點實驗室，中國陜西楊凌 712100；2Department of Entomology，Texas A&M University，Texas 77843，USA）

0 引言

【研究意義】麥紅吸漿蟲（Sitodiplosis mosellana）是小麥生產(chǎn)上間隙性猖獗成災的重要害蟲[1-2]，以幼蟲潛伏在穎殼內吸食正在灌漿的籽粒汁液，造成麥粒癟瘡、空殼或霉爛，一般使小麥減產(chǎn)10%—20%，重者30%—50%，甚至顆粒無收，嚴重影響小麥的產(chǎn)量和品質，甚至根本不能食用[3]。實踐證明，選育和推廣種植抗蟲品種是降低吸漿蟲危害最安全和經(jīng)濟有效的途徑[4-5]。探究小麥灌漿期籽粒次生物質含量與小麥抗吸漿蟲的關系，以及不同抗性品種次生物質含量對麥紅吸漿蟲幼蟲解毒酶活性及其編碼基因表達的影響，對深入研究小麥對吸漿蟲的抗性機制及抗蟲品種的選育具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】為了避免或減輕植食性昆蟲的危害，植物與昆蟲在長期的協(xié)同進化過程中形成了一系列防御機制，抗生性是植物抗蟲的主要機制之一，植物的抗生性與次生物質含量關系密切，如高粱對西南玉米桿螟（Diatraea grandiosella）、小麥籽粒對玉米象（Sitophilus zeamais）、棉花對棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）和綠盲蝽（Apolygus lucorum）的抗性分別與生腈糖苷、阿魏酸、單寧和棉酚等含量有密切關系[6-9]。為抵御次生物質的毒害，植食性昆蟲也演化出了多種反防御機制。當取食不同寄主或不同類型次生物時，昆蟲體內的解毒酶會變化，從而對攝入的有毒物質進行解毒和排毒[10]。谷胱甘肽-S-轉移酶（glutathione S-transferase，GST）、羧酸酯酶（carboxylesterase，CarE）和細胞色素 P450 酶系（cytochrome P450，CYP450）是昆蟲體內最重要的解毒酶，其活性和基因表達水平能夠被多種次生物質誘導，以此增強對次生物質的代謝能力和對寄主的適應性[11-14]。研究表明，兒茶素和蘆竹堿可以誘導麥長管蚜（Sitobion avenae）CarE和GST活性升高[15]，單寧可以誘導楊小舟蛾（Micromelalopha troglodyte）GSTd1的表達[16]；亞洲小車蝗（Oedaleous asiaticus）取食含單寧、黃酮、苯酚等次生物質含量高的抗性寄主冷蒿后，體內GST、CarE和P450活性及相關基因表達量顯著升高[17]。【本研究切入點】多年來，國內外對小麥抗吸漿蟲性進行了大量研究，發(fā)現(xiàn)不同品種（系）小麥對吸漿蟲的抗性不同[18-20]，抗性不同品種間次生物質含量亦存在差異[21-22]，但小麥籽粒次生物質是否對吸漿蟲解毒酶產(chǎn)生影響，解毒酶在吸漿蟲對植物次生物質代謝及寄主適應性中所起作用尚不清楚。【擬解決的關鍵問題】分析不同抗性品種（系）小麥次生物質（單寧、總黃酮、阿魏酸、總酚）含量與小麥抗吸漿蟲指標，以及與取食不同品種（系）的麥紅吸漿蟲幼蟲3種解毒酶（GST、CarE和CYP450）活性及相關基因表達的關系，明確影響小麥抗麥紅吸漿蟲的關鍵次生物質及麥紅吸漿蟲對次生物質的解毒機制，為麥紅吸漿蟲綜合治理和抗蟲品種的培育提供新思路。

1 材料與方法

試驗于 2015—2017年分別在陜西省西安市周至縣和西北農(nóng)林科技大學農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西北黃土高原作物有害生物綜合治理重點實驗室完成。

1.1 供試小麥品種（系）

選取生育期相同或相近，抽穗期（敏感期）與麥紅吸漿蟲羽化高峰期吻合，前期鑒定連續(xù)多年對麥紅吸漿蟲抗性表現(xiàn)穩(wěn)定的抗蟲小麥品種（系）晉麥47、科農(nóng)1006、陜麥139和陜農(nóng)33，及感蟲品種（系）小偃22、西農(nóng)822、西農(nóng)88和小偃6號[20]。所有品種（系）均來源于西北農(nóng)林科技大學農(nóng)學院。

1.2 田間試驗設計

將供試材料于 2015年小麥適播期播種于麥紅吸漿蟲重發(fā)區(qū)陜西省西安市周至縣試驗地（N34°9′，E109°10′），每品種3個重復，每重復10行，行長1.5 m。翌年春季淘土調查蟲口密度為390萬頭/667 m2，試驗地常規(guī)管理，不施用任何農(nóng)藥，各品種（系）在田間自然感蟲。

1.3 小麥品種（系）被害調查與試驗樣品收集

小麥灌漿期，每個品種（系）小麥各重復隨機取50穗，帶回室內逐穗、逐粒剝查并記載麥粒中的麥紅吸漿蟲幼蟲數(shù)；同時收集各品種（系）健康籽粒，保存于-20℃，用于次生物質含量測定；收集足夠多危害各品種（系）小麥籽粒的蟲齡一致的幼蟲，齡期依據(jù)蟲體大小、顏色和Y型劍骨片有無區(qū)分[18]，收集的幼蟲每30頭分裝于2.0 mL凍存管，液氮速凍后-80℃保存，用于解毒酶活性和基因表達分析。調查結束后，計算每個品種（系）的平均穗被害率、粒被害率、單穗幼蟲數(shù)和估計損失率。計算估計損失率時，麥粒中的幼蟲數(shù)分為5級：0級：無蟲/粒；1級：1頭/粒；2級：2頭/粒；3級：3頭/粒；4級：≥4頭/粒[20]。

1.4 小麥灌漿期籽粒次生物質含量測定

將收集的小麥籽粒80℃烘干至恒重，研磨成粉，過100目篩子后用于次生物質含量的測定，其中阿魏酸含量以阿魏酸為標品，采用比色皿法測定[23]，單寧含量以兒茶素為標準品，采用香草醛法測定[6]，總酚含量以沒食子酸為標準品，采用Folin-Ciocalteu法測定[24]，總黃酮含量以蘆丁為標準品，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法測定[25]。每處理重復3次。

1.5 麥紅吸漿蟲幼蟲GST、CarE和CYP450活性分析

1.5.1 酶液制備 從冰箱中取出各樣品，稱重后放入1.5 mL 離心管，分別加入 500 μL 0.04 mol·L-1pH 7.0、0.1 mol·L-1pH 6.5 和 0.1 mol·L-1pH 7.8 的磷酸緩沖液（含 1 mmol·L-1EDTA、1 mmol·L-1PMSF 和 1 mmol·L-1DTT），充分研磨后，勻漿液于4℃ 12 000×g下離心10 min，上清液分別為 CarE、GST 和 CYP450 酶液[26]。測試時，酶液再用緩沖液稀釋成最佳取樣濃度。每處理30頭試蟲，重復3次。

1.5.2 酶活力測定 3種解毒酶的活力均采用上海泛柯實業(yè)有限公司生產(chǎn)的酶聯(lián)免疫分析試劑盒測定，具體操作步驟按試劑盒說明進行。

GST活力測定原理：用純化的昆蟲GST抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入 GST標準品和待測酶液，再與辣根過氧化物酶（HRP）標記的GST抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經(jīng)徹底洗滌后加底物四甲基聯(lián)苯胺（TMB）顯色。用酶標儀在 450 nm波長下測定 OD值，通過標準曲線計算樣品中GST活性。

CarE和CYP450活力測定原理與GST相同，區(qū)別僅在于以相應的酶標抗體進行包被。

以37℃下每毫克組織蛋白每分鐘轉化1 μmol底物（TMB）的酶量為一個活力單位（U/mg protein）。

1.5.3 酶蛋白濃度測定 以牛血清蛋白（BSA）為標準蛋白，采用考馬斯亮藍G-250染色法測定[27]。

1.6 麥紅吸漿蟲GST、CarE和CYP450表達水平分析

1.6.1 總RNA提取和cDNA合成 分別取危害各品種（系）小麥的麥紅吸漿蟲幼蟲30頭，按照TRNzol總RNA提取試劑盒（TIANGEN，北京）操作說明提取總 RNA，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）反轉錄試劑盒（TaKaRa，大連）說明合成單鏈cDNA。重復3次。

1.6.2 熒光定量 PCR檢測 在麥紅吸漿蟲幼蟲轉錄組數(shù)據(jù)庫搜索GST、CarE和CYP450酶編碼基因，從中挑選表達量高的GST1、CarE2和CYP6A1Unigene序列設計定量引物（表 1）。以麥紅吸漿蟲GAPDH（GenBank登錄號：KR733066）為內參，合成的cDNA為模板，按照 SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）試劑盒說明書（TIANGEN，北京），在iQ5 Real-Time PCR Detection System（Bio-Rad，Hercules，CA）上進行 qPCR 分析。反應體系（20 μL）：2×SuperReal PreMixPlus 10 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各 0.8 μL，cDNA 模板 1.0 μL，RNase Free H2O 7.4 μL。擴增程序：95℃預變性 15 min；95℃變性 30 s，55℃退火30 s，72℃延伸 30 s，40 個循環(huán)；最后 95℃ 30 s，55℃1 min，95℃ 15 s，進行熔解曲線分析，反應結束后讀取Ct值。每樣品進行3次技術重復。

表1 qPCR中應用的引物序列Table 1 Primer sequences for qPCR

1.7 數(shù)據(jù)分析

以取食陜麥139的麥紅吸漿蟲幼蟲為基準，采用2-ΔΔCT法[28]計算危害各品種（系）小麥的麥紅吸漿蟲幼蟲解毒酶基因相對表達量。小麥品種（系）間受害程度、次生物質含量、解毒酶活性和基因表達量進行單因素方差分析（P＜0.05），Duncan氏新復極差法進行多重比較；Pearson法分析次生物質含量與小麥抗蟲指標、解毒酶活性，以及基因表達量與酶活性間的相關性，所有分析在SPSS 19.0（Chicago，IL，美國）統(tǒng)計軟件包上進行。

2 結果

2.1 不同品種（系）小麥受麥紅吸漿蟲危害程度

由表2可知，不同品種（系）小麥受害程度差異明顯，其中前期鑒定為抗蟲的4個品種晉麥47、科農(nóng)1006、陜麥139和陜農(nóng)33穗被害率、粒被害率、單穗蟲口數(shù)和估計損失率分別為30.67%—69.67%、3.20%—7.11%、1.10—5.07頭和 0.42%—2.43%，均顯著低于4個感蟲品種小偃22、西農(nóng)822、西農(nóng)88和小偃6號對應的 89.33%—95.33%、11.51%—15.15%、7.57—14.24頭和 4.25%—6.12%（P＜0.05）?？瓜x品種和感蟲品種內部受害程度也存在一定的差異，在抗蟲品種中以陜麥139受害最輕，科農(nóng)1006和晉麥47次之，陜農(nóng)33受害較重；感蟲品種中以小偃22受害最重，除穗被害率外，其他幾個指標均顯著高于西農(nóng) 822、西農(nóng)88和小偃6號。

2.2 不同品種（系）小麥籽粒次生物質含量比較

由表 3可知，不同小麥品種（系）灌漿期籽粒阿魏酸、單寧、總酚和總黃酮含量差異明顯，其中阿魏酸和單寧含量在抗蟲品種科農(nóng) 1006中最高，分別為6.57和2.17 mg·g-1，顯著高于所有感蟲品種，在感蟲品種西農(nóng)822和小偃6號中最低，分別為4.61和1.02 mg·g-1，顯著低于其他品種（系）?？偡雍吭诳瓜x品種晉麥47中最高（24.86 mg·g-1），低抗品種陜農(nóng)33中最低（12.56 mg·g-1）。總黃酮含量在感蟲品種西農(nóng) 88 中最高（3.93 mg·g-1），顯著高于其他品種（系），小偃 6 號中最低（1.91 mg·g-1）。

表2 麥紅吸漿蟲幼蟲對8個品種（系）小麥的危害程度Table 2 Damage degree of eight wheat varieties (lines) caused by S. mosellana larvae

表3 8個品種（系）小麥籽粒次生物質含量Table 3 Contents of secondary metabolites in wheat kernels of eight varieties (lines)

2.3 小麥籽粒次生物質含量與抗蟲性的關系

以抗、感程度不同的各品種（系）小麥穗被害率、粒被害率、單穗蟲口數(shù)和估計損失率為抗蟲指標，與小麥籽粒4種次生物質含量進行相關性分析，結果表明，阿魏酸含量與 4個抗蟲指標均呈顯著負相關（P＜0.05），單寧、總酚和總黃酮含量與4個抗蟲指標的相關性均未達顯著水平（P＞0.05）（表4）。

2.4 小麥品種（系）對麥紅吸漿蟲GST、CarE和CYP450活性的影響

由表5可知，取食抗、感程度不同品種（系）小麥的麥紅吸漿蟲幼蟲體內GST、CarE和CYP450活性差異明顯。除小偃6號外，取食感蟲品種小偃22、西農(nóng)822和西農(nóng)88的幼蟲GST和CarE活性均低于4個抗蟲品種，其中取食西農(nóng)88的GST和CarE活性最低，分別為0.0963和 0.1016 U/mg protein，取食科農(nóng) 1006和陜麥 139的最高，分別為 0.2144和 0.2284 U/mg protein。對于 CYP450，以取食小偃6號的活性最高，其次為西農(nóng) 822，分別為 0.1885和 0.1791 U/mg protein，取食其他品種的幼蟲間差異不顯著。

2.5 麥紅吸漿蟲幼蟲體內解毒酶活性與小麥籽粒次生物質含量的關系

對取食不同小麥品種（系）的麥紅吸漿蟲幼蟲 3種解毒酶活性與小麥籽粒次生物質含量進行相關性分析，結果表明，GST和CarE活性與阿魏酸含量呈顯著正相關（P＜0.05），與單寧、總酚和總黃酮含量相關性不顯著（P＞0.05）；CYP450活性與單寧含量呈顯著負相關（P＜0.05），與阿魏酸、總酚和總黃酮含量相關性不顯著（P＞0.05）（表6）。

表4 小麥籽粒次生物質含量與小麥抗吸漿蟲指標的相關性Table 4 Correlation between resistance indicators of wheat to S. mosellena and contents of secondary metabolites in wheat kernels

表5 取食8個品種（系）小麥的麥紅吸漿蟲幼蟲解毒酶活性Table 5 Detoxification enzyme activities of S. mosellana larvae feeding on eight wheat varieties (lines)

表6 麥紅吸漿蟲幼蟲體內解毒酶活性與小麥籽粒次生物質含量的相關性Table 6 Correlation between detoxification enzyme activities of S. mosellana larvae and contents of secondary metabolites in wheat kernels

2.6 小麥品種（系）對麥紅吸漿蟲幼蟲GST1、CarE2和CYP6A1表達的影響

取食不同小麥品種（系）的麥紅吸漿蟲幼蟲GST1和CarE2表達量存在明顯差異，其中取食抗蟲品種晉麥47、科農(nóng)1006、陜麥139和陜農(nóng)33的表達水平顯著高于取食感蟲品種小偃22、西農(nóng)822、西農(nóng)88和小偃6號（P＜0.05）。GST1表達量在取食陜農(nóng)33的幼蟲中最高，為陜麥139的1.42倍，顯著高于其他品種；在取食小偃22的幼蟲中最低，為陜麥139的0.15倍。CarE2表達量在取食陜麥139的幼蟲中最高，顯著高于取食其他品種，在取食小偃22的幼蟲中最低，僅為取食陜麥139幼蟲的0.07倍（圖1-A、1-B）。

取食不同抗蟲性小麥品種（系）的麥紅吸漿蟲幼蟲CYP6A1表達量沒有表現(xiàn)出一定的規(guī)律，取食抗蟲品種陜麥139、晉麥47和感蟲品種小偃22、西農(nóng)88的表達量較高且無顯著差異，取食抗蟲品種科農(nóng)1006和感蟲品種西農(nóng)822的表達量較低且無顯著差異（圖1-C）。

圖1 取食8個小麥品種（系）的麥紅吸漿蟲幼蟲GST1、CarE2和CYP6A1相對表達量Fig. 1 Relative expression level of GST1, CarE2 and CYP6A1 in S. mosellana larvae feeding on eight wheat varieties (lines)

2.7 取食不同小麥品種（系）的麥紅吸漿蟲解毒酶活性與基因表達水平的關系

相關性分析結果表明，取食不同小麥品種（系）的麥紅吸漿蟲幼蟲GST1表達水平與 GST活性（r=0.772，P=0.043）、CarE2表達水平與 CarE活性均呈顯著正相關（r=0.756，P=0.030），CYP6A1表達水平與 CYP450活性相關性不顯著（r=0.558，P=0.150）。

3 討論

植物次生物質是化學防御的物質基礎，能影響或幫助植物抵御昆蟲的侵害，植物品種間抗生性差異與體內各類型次生物質組成和含量密切相關[6-9]。本研究發(fā)現(xiàn)小麥對麥紅吸漿蟲的抗性與小麥灌漿期籽粒單寧、總酚和總黃酮含量相關性不顯著，但與阿魏酸含量呈顯著正相關，即阿魏酸對吸漿蟲抗性的貢獻較單寧、總酚和總黃酮大，其含量越高，對吸漿蟲抗性越強。這與小麥對麥長管蚜、玉米象及水稻對褐飛虱（Nilaparvata lugens）抗性與阿魏酸含量顯著正相關的結果一致[9,29-30]。研究表明，阿魏酸不僅是構成植物細胞壁的重要成分，而且可顯著抑制麥二叉蚜（Schizaphis graminum）和斜紋夜蛾（Spodoptera litura）的取食和生存[31-32]，并能降低棉鈴蟲幼蟲、蛹的體重和影響幼蟲對食物的吸收與利用[7]。據(jù)此推測，阿魏酸作為小麥抗麥紅吸漿蟲的關鍵次生物質，可能通過降低麥紅吸漿蟲對食物的吸收效率，抑制其取食和生長發(fā)育，以此達到抵御侵害的目的。

解毒酶及解毒機制在昆蟲對植物次生物質的代謝和寄主適應中起著重要作用。作為昆蟲重要的解毒酶，谷胱甘肽-S-轉移酶（GST）可催化還原型谷胱甘肽與各種親電有毒次生物進行加成反應，形成親水性更強的無毒或低毒物而排出體外[33]；羧酸酯酶（CarE）則能催化含酯鍵、酰胺鍵的外源與內源次生代謝物質水解[15]。許多研究證明寄主抗蟲性和植物次生物質可影響解毒酶活性及相關基因表達，以此增加對次生物質的防御適應性。綠豆象（Callosobruchus chinensis）取食抗蟲綠豆品種、麥長管蚜取食抗蟲品種小麥后體內CarE和GST活性顯著高于取食感蟲品種[34-35]；飼喂阿魏酸可顯著提高褐飛虱若蟲GST和CarE活性及其編碼基因NlGSTe1、NlGSTd1和NlCarE的表達[30]；用含0.5%單寧、0.2%蘆丁或1%沒食子酸的飼料飼喂斜紋夜蛾后，5齡幼蟲中腸和脂肪體GST和CarE活性及SlGSTe1和SlCarE表達量顯著增加[12]。本研究表明，麥紅吸漿蟲幼蟲取食阿魏酸含量高的抗蟲品種小麥后，GST和CarE活性及GST1和CarE2表達量均顯著高于取食感蟲品種，GST和CarE活性與阿魏酸含量及對應基因表達水平顯著正相關，與以上結果相符，說明GST和CarE及其基因GST1和CarE2在麥紅吸漿蟲對寄主小麥有毒次生物質的代謝和防御中起著重要作用。

細胞色素 P450酶系（CYP450）在昆蟲對植物次生物質的解毒代謝中也發(fā)揮了重要作用，許多研究報道了植物次生物質對昆蟲 CYP450活性的影響。萜類植物次生代謝物棉酚可誘導棉鈴蟲CYP450的活性，棉鈴蟲取食棉酚含量高的寄主植物后，CYP450活性顯著升高[36]；吲哚-3-甲醇、花椒毒素、2-十三玩酮等多種植物次生物質可誘導草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）幼蟲 CYP450的活性[37]。與之不同，2-十三烷酮卻通過降低棉鈴蟲 6 齡幼蟲CYP450活性，使其在含量較低的情況下具有較高的毒性[38]。本研究發(fā)現(xiàn)，麥紅吸漿蟲幼蟲 CYP450活性與小麥籽粒單寧含量顯著負相關，即單寧可降低CYP450活性。單寧具有靴化蛋白的特性，是多種酶促反應的抑制劑[39-40]，據(jù)此推測單寧可能與吸漿蟲CYP450相關蛋白結合，通過抑制其活性和作用過程，阻止或降低其解毒代謝，使蟲體生命力“弱化”而發(fā)揮毒殺作用。CYP6亞家族基因代謝解毒作用是昆蟲寄主適應的重要機制，不同次生物質所誘導的CYP6不同。棉酚能夠誘導棉鈴蟲CYP6AE11和CYP6B7過量表達，而槲皮素和單寧酸僅能誘導CYP6B6的表達[36,41]。本研究發(fā)現(xiàn)單寧雖然能夠抑制麥紅吸漿蟲CYP450的活性，但是對CYP6A1表達無顯著影響，這可能是由于 CYP450活性由多基因控制，特定的植物次生物質對不同CYP6誘導或抑制作用不同[11,41-42]，而CYP6A1可能不是麥紅吸漿蟲幼蟲響應單寧脅迫的關鍵基因。

4 結論

小麥灌漿期籽粒阿魏酸是影響小麥對麥紅吸漿蟲抗性的主要次生物質，阿魏酸含量高的寄主能夠誘導麥紅吸漿蟲幼蟲GST和CarE活性及編碼基因GST1和CarE2的表達，這些酶及基因在麥紅吸漿蟲對阿魏酸的解毒代謝和防御反應中發(fā)揮著重要作用。單寧卻通過降低吸漿蟲幼蟲CYP450的活性使其在含量較低的情況下具有相對高的毒殺作用。