郭世倫 張斌斌 李惠洋 劉鴻雁 劉權(quán)

摘 要：AMEP蛋白是從枯草芽孢桿菌中分離鑒定的一種新型蛋白激發(fā)子，能夠激發(fā)植物免疫，提高植物抗病性。經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，AMEP蛋白的編碼基因在芽孢桿菌屬的菌株中廣泛分布，但各菌株AMEP蛋白的表達(dá)產(chǎn)量和活性還有待研究。該研究對實驗室保藏的多株芽孢桿菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定基因，篩選出含有AMEP編碼基因的菌株;通過蛋白表達(dá)純化和定量確定了各菌株AMEP蛋白的表達(dá)量;并通過過敏反應(yīng)試驗比較各菌株AMEP蛋白的功能活性，確定菌株BU396 產(chǎn)AMEP蛋白的表達(dá)量最高，且具有正常的功能活性，適合于作為今后AMEP蛋白的表達(dá)菌株。

關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì)激發(fā)子;芽孢桿菌;蛋白產(chǎn)量;過敏反應(yīng);蛋白活性

中圖分類號 Q936文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 1007-7731（2020）20-0023-03

Analysis of Expression and Activity of AMEP Protein in Different Bacillus

GUO Shilun et al.

（Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163000，China）

Abstract：AMEP protein is a new protein elicitor isolated and identified from Bacillus subtilis，which can stimulate plant immunity and promote plant disease resistance. Bioinformatics analysis showed that the coding gene of AMEP protein was widely distributed in Bacillus strains，but the expression level and activity of AMEP protein in individual strain remained to be studied. In this paper，the strains containing AMEP coding gene were identified by PCR amplification. Then the expression level of AMEP protein in each strain was determined by protein expression and purification. Finally，the activity of AMEP protein produced by each strain was determined by hypersensitive reaction assay. BU396 was screened out for both good expression level and high activity，which was suitable for the future application.

Key words：Protein elicitor;Bacillus sp.;Protein yield;Hypersensitive reaction;Protein activity

激發(fā)子是可以刺激植物產(chǎn)生防衛(wèi)反應(yīng)的一類物質(zhì)[1]。根據(jù)來源的不同，激發(fā)子可以分為生物源激發(fā)子和非生物源2種[2]。蛋白質(zhì)激發(fā)子是生物源激發(fā)子，一般為與植物互作的病原菌或生防菌分泌，可以誘導(dǎo)植物的防衛(wèi)反應(yīng)，同時部分激發(fā)子還可以調(diào)節(jié)植物生長代謝，促進(jìn)植物生長[3]。

AMEP蛋白是從枯草芽孢桿菌BU412中發(fā)現(xiàn)的一種新型蛋白激發(fā)子，可以誘導(dǎo)植物產(chǎn)生過敏反應(yīng)（Hypersensitive reaction，HR），并提高了植物的抗病性[4]。此外，研究還發(fā)現(xiàn)該蛋白具有對病原菌的拮抗作用和對有害昆蟲的殺蟲活性[5-6]。AMEP蛋白作為一種多功能的蛋白質(zhì)激發(fā)子，可應(yīng)用到生物防治領(lǐng)域，具有開發(fā)為蛋白質(zhì)生物農(nóng)藥的潛質(zhì)。

BLAST比對顯示，AMEP蛋白的編碼基因在芽孢桿菌屬內(nèi)廣泛分布。經(jīng)本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，AMEP蛋白在多種芽孢桿菌中均有表達(dá)，但其表達(dá)量與活性因菌株的不同存在較大差異。要進(jìn)一步對AMEP蛋白進(jìn)行研究和開發(fā)，篩選出能夠高效表達(dá)高活性AMEP蛋白的菌株尤為關(guān)鍵。

為了得到AMEP蛋白產(chǎn)量與活性最佳的菌株，本研究通過分析AMEP蛋白的編碼基因，設(shè)計通用性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選出含有AMEP蛋白基因的菌株。并對各菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，通過蛋白純化和定量檢測確定蛋白表達(dá)量，通過過敏反應(yīng)試驗檢測蛋白活性。本研究旨在篩選得到AMEP蛋白產(chǎn)量與活性最佳的菌株，為該蛋白的開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料 本試驗篩選所用芽孢桿菌菌株均為本實驗室保藏。煙草植株為Nicotiana tabacum，培養(yǎng)42d后取葉片進(jìn)行過敏反應(yīng)試驗。

1.2 PCR篩選陽性菌株 為了篩選得到含有AMEP蛋白編碼基因的芽孢桿菌菌株，對本實驗室保藏的多株芽孢桿菌進(jìn)行了PCR檢測分析。通過分析AMEP蛋白的編碼基因，設(shè)計了通用性引物（正向引物F：CGCGGATCCTTGTTCGGACCAATTTTA;反向引物R：CCGCTCGAGTTAGCCAAGAATCATTTT），通過菌液PCR擴(kuò)增，檢驗各菌株中是否含有AMEP蛋白的基因。PCR擴(kuò)增采用50μL反應(yīng)體系，包括：1μL細(xì)菌菌液，上下游引物各0.5μL，1.2μL 10μmol/L dNTPs，4μL 50mmol/L MgCl2，5μL 10×PCR buffer，0.3μL Taq DNA聚合酶。PCR反應(yīng)的擴(kuò)增程序為：95℃預(yù)變性5min;95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，40個循環(huán)，4℃∞。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中是否含有250bp的目的條帶，判斷菌株是否為含有AMEP基因的陽性菌株。

1.3 各菌株中AMEP的表達(dá)量檢測

1.3.1 菌株培養(yǎng) 采用平板三線法在LB平板進(jìn)行菌株培養(yǎng)，挑取單克隆接種至YME液體培養(yǎng)基，在28℃、175r條件下培養(yǎng)24h。

1.3.2 AMEP蛋白的純化與定量（1）發(fā)酵液預(yù)處理：將培養(yǎng)24h的發(fā)酵液取出50mL裝入離心管中，在4℃的條件下以11000g離心15min，得到上清液。使用0.22μM的濾膜進(jìn)行過濾除雜后備用。（2）過柱：根據(jù)AMEP蛋白的理化性質(zhì)使用Source 15Q 4.6/100PE陰離子交換柱對目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離純化。使用低鹽緩沖液（20mM的Tris-HCl，pH7.5）平衡柱體，上樣平衡后，使用40%的高鹽緩沖液（20mM的Tris-HCl，1M NaCl，pH7.5）進(jìn)行洗脫，收集蛋白樣品。使用分子截留體積為30kDa的超濾管對蛋白樣品進(jìn)行超濾，舍棄<30kDa的蛋白樣品，收集截留的蛋白樣品，即為純化好的AMEP蛋白。（3）蛋白濃度測定：使用微量分光光度計Nanodrop對蛋白樣品進(jìn)行濃度測定。波長調(diào)整為280nm，每次滴樣品之前使用低鹽緩沖液調(diào)零，記錄每次得到的數(shù)據(jù)，經(jīng)過換算，得到各菌株AMEP蛋白的表達(dá)水平。

1.4 各菌株AMEP蛋白活性檢測 通過過敏反應(yīng)實驗檢驗各陽性菌株表達(dá)AMEP蛋白的活性。首先將AMEP蛋白進(jìn)行稀釋，控制目標(biāo)蛋白質(zhì)濃度為0.5mg/mL，使用無針頭的注射器將0.2mL樣品量注射到煙草葉片背面，以低鹽緩沖液作為對照組。將處理過的煙草葉片置于黑暗避光環(huán)境中，室溫放置24h后取出觀察，根據(jù)枯斑大小對蛋白活性進(jìn)行評估[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 各芽孢桿菌菌株中AMEP蛋白編碼基因 通過分析AMEP蛋白的編碼基因，設(shè)計了通用性引物，通過菌液PCR擴(kuò)增檢測AMEP編碼基因的分布。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在本實驗室保藏的多株芽孢桿菌中，共有4株芽孢桿菌包含有AMEP基因（圖1），依次為1、7、10、13泳道樣品，對應(yīng)的菌株編號分別為BU66、BU108、BU278和BU396。

2.2 各芽孢桿菌菌株AMEP蛋白表達(dá)量的差異 經(jīng)過對AMEP蛋白的表達(dá)、純化以及濃度測定，檢測了各芽孢桿菌菌株（BU66、BU108、BU278、BU396和BU412）中AMEP蛋白表達(dá)量的差異，其結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，5株菌中菌株BU396為AMEP蛋白產(chǎn)量最高的菌株，其產(chǎn)量可達(dá)到1.8mg/mL。其他4株菌株BU108、BU278、BU412和BU66的AMEP的蛋白產(chǎn)量分別為1.37mg/mL、1.73mg/mL、1.72mg/mL和1.12mg/mL。5株芽孢桿菌中，菌株BU66目標(biāo)蛋白的產(chǎn)量最低僅為1.12mg/mL。菌株BU396的AMEP蛋白產(chǎn)量顯著高于其他菌株，而BU66、BU108的AMEP蛋白產(chǎn)量則顯著低于其他菌株。

2.3 各芽孢桿菌菌株AMEP蛋白活性的差異 將測定濃度的AMEP蛋白進(jìn)行稀釋，控制蛋白濃度為0.5mg/mL，以低鹽溶液作為對照組CK。采取0.2mL樣品量分3次注射于煙草葉片后，將煙草置于黑暗環(huán)境下24h后觀察煙草葉片壞死枯斑的大小，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，在5株菌株中菌株BU66中AMEP蛋白活性最低，其他4株菌株蛋白激發(fā)子活性則大致基本相同。綜合分析，可以確定BU396菌株的AMEP蛋白產(chǎn)量最高，且活性好，適合為今后AMEP蛋白的表達(dá)菌株。

3 討論

本研究通過PCR基因擴(kuò)增、蛋白質(zhì)純化和過敏反應(yīng)等方法，最終從5株芽孢桿菌中成功篩選得到了AMEP蛋白產(chǎn)量和活性最佳的菌株BU396。在相同的培養(yǎng)條件下，菌株BU396分泌的AMEP蛋白量可達(dá)1.8mg/mL，顯著高于其他4株菌株;在蛋白質(zhì)激發(fā)子活性比較過程中，菌株BU396和菌株BU108、BU278和BU412蛋白質(zhì)激發(fā)子的活性無明顯差異。然而菌株BU66蛋白質(zhì)激發(fā)子活性明顯低于其他4株菌株。

激發(fā)子可引起植物的過敏反應(yīng)（HR）。HR是植物在被病原菌侵染過程中的一種應(yīng)激反應(yīng)，其主要表現(xiàn)為被侵染部位的組織發(fā)生局部壞死以防止病原菌在植物體內(nèi)進(jìn)一步擴(kuò)散[8-9]。根據(jù)激發(fā)子的特性，本實驗通過煙草過敏反應(yīng)發(fā)現(xiàn)不同芽孢桿菌菌株表達(dá)的AMEP蛋白的活性存在差異。由于不同菌株表達(dá)的AMEP蛋白均為同一編碼基因經(jīng)過轉(zhuǎn)錄所得，推測AMEP蛋白分子空間結(jié)構(gòu)存在差異，從而造成了AMEP蛋白活性的差異。蛋白質(zhì)分子從低級結(jié)構(gòu)到高級結(jié)構(gòu)的組裝過程中，蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)受到諸多因素的影響，如溫度、pH值、折疊酶和分子伴侶等[10-12]。菌株BU66的AMEP蛋白活性明顯低于其他4株菌株，推測菌株BU66中AMEP蛋白的折疊過程可能存在缺陷，導(dǎo)致AMEP蛋白不能形成正確空間結(jié)構(gòu)。

在AMEP蛋白質(zhì)表達(dá)的研究過程中，菌株間AMEP蛋白的表達(dá)量存在明顯差異，這可能是由AMEP蛋白基因在不同芽孢桿菌中表達(dá)情況存在差異所導(dǎo)致的。根據(jù)基因表達(dá)的位置效應(yīng)[13-14]，AMEP蛋白基因在芽孢桿菌基因組的位置可能存在差異，造成基因在轉(zhuǎn)錄水平上的差異，從而使得不同芽孢桿菌蛋白的表達(dá)量存在差異。BU66菌株的蛋白表達(dá)產(chǎn)量最低，且活性也差，導(dǎo)致不能作為備選菌株，而BU108菌株的蛋白活性雖好，但其表達(dá)量偏低，也不適合作為備選菌株。

綜上所述，本試驗成功篩選得到了1株適合用于AMEP蛋白表達(dá)的芽孢桿菌BU396，該菌株在AMEP蛋白質(zhì)表達(dá)量以及活性方面較其他4株菌株具有明顯優(yōu)勢。本試驗結(jié)果為AMEP蛋白的高效優(yōu)質(zhì)表達(dá)和AMEP蛋白激發(fā)子在植物病害防治的實際應(yīng)用提供了依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1]Waadt R，Schmidt L K，Lohse M，et al.Multicolor bimolecular fluorescence complementation reveals simultaneous formation of alternative CBL/CIPK complexes in planta[J].Plant Journal，2010，56（3）：505-516.

[2]Freydl E，Meins F，Boller T，et al.Kinetics of prolyl hydroxylation，intracellular transport and C-terminal processing of the tobacco vacuolar chitinase[J].Planta，1995，197（2）：250-256.

[3]Scheel D，Parker J E.Elicitor recognition and signal transduction in plant defense gene activation[J].Ztschrift Für Naturforschung C，1990，45（6）：569-575.

[4]Shen Y R，Li J W，Xiang J L，et al.Isolation and identification of a novel protein elicitor from a Bacillus subtilis strain BU412[J].AMB Express，2019，9：117.

[5]Liu Q，Shen Y R，Yin K D.The antimicrobial activity of protein elicitor AMEP412 against Streptomyces scabiei[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology，2020，36：18.

[6]Liu Q，Zhang B B，Shen Y R，et al.Effect of the protein elicitor AMEP412 from Bacillus subtilis artificially fed to adults of the whitefly，Bemisia tabaci（Genn.）（Hemiptera：Aleyrodidae）[J].Egyptian Journal of Biological Pest Control，2020，30：3.

[7]王炳楠.大麗輪枝菌蛋白激發(fā)子純化、基因克隆與功能分析[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2011.

[8]Ongena M，Jourdan E，Adam A，et al.Surfactin and fengycin lipopeptides of Bacillus subtilis as elicitors of induced systemic resistance in plants[J].Environmental Microbiology，2007，9（4）：1084-1090.

[9]T.Nürnberger.Signal perception in plant pathogen defense[J].Cellular & Molecular Life Sciences Cmls，1999，55（2）：167-82.

[10]閆榮玲，廖陽.正確的高級結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)生物學(xué)活性的基本前提[J].生物學(xué)教學(xué)，2015，40（11）：59-60.

[11]王志珍.蛋白質(zhì)折疊和分子伴侶[J].生物學(xué)通報，2004，05：1-6.

[12]井明艷，孫建義.蛋白質(zhì)的折疊調(diào)控與包涵體的形成[J].浙江大學(xué)學(xué)報（農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版），2004，06：104-110.

[13]顧小飛，曾慶超，李蓉，等.枯草芽孢桿菌9407基因組中生防相關(guān)抗生素基因簇的分析[D]//中國植物病理學(xué)會.中國植物病理學(xué)會2019年學(xué)術(shù)年會論文集.2019：376.

[14]張小飛.酶活性中心穩(wěn)定化策略提高褶皺假絲酵母脂肪酶的穩(wěn)定性[D].上海：上海交通大學(xué)，2016.

（責(zé)編：張宏民）