牟 超

(撫順市現(xiàn)代農業(yè)及扶貧開發(fā)促進中心，遼寧 撫順 113000)

香菇富含多種營養(yǎng)（包括維生素、蛋白質、脂肪酸、氨基酸、礦物質元素），同時具有宜人的香氣，食之味道鮮嫩，口感絕佳，食用價值較高。香菇又被稱為冬菇或香蕈，在分類學中屬于擔子菌綱，傘菌目，口蘑科，香菇屬，是一種為人們所喜愛的常見食用菌。

中國是香菇消費和生產的大國，并且中國的香菇栽培規(guī)模也位列于世界的前端，然而在香菇的育種研究方面卻有些許落后。所以，當務之急是香菇新品種研發(fā)以及原有品種的改良工作。目前較為常用的育種手段是原生質體技術，這一技術能夠在一定程度上有效縮短食用菌的育種周期，但是，此項技術還未在全國范圍內進行推廣實施，目前由原生質體技術所派生出的育種技術主要有以下4類，原生質體誘變、原生質體轉化、原生質體融合、原生質體單核化。相對于其他育種方式而言，原生質體育種具有育種周期短、效率高的特點，同時對于食用菌的品質、產量以及抗性都有顯著的提升效果，進而提高香菇的育種水平。這個過程里面原生質體育種的基礎是原生質體的制備和再生。所以，本文重點研究外部環(huán)境條件對于香菇原生質體產量與再生率的影響，以此作為食用菌類的原生質體育種工作的參照。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試食用菌種： 香菇（Letinula Edodes）遼撫4號編號0912，由撫順市農業(yè)科學研究院提供；母種培養(yǎng)基（克/升）：馬鈴薯200.0、蔗糖10.0、葡萄糖10.0、蛋白胨2.0、木屑150.0（煎汁過濾）、硫酸鎂0.5、磷酸二氫鉀1.0、水1000.0、瓊脂粉12.0，培養(yǎng)基的酸堿度調整至5.5；再生培養(yǎng)基：與母種相同，外加穩(wěn)滲劑進行定容。

穩(wěn)滲劑配置：甘露醇、0.4摩爾/升的硫酸鎂、氯化鈉、氯化鉀，pH=5的蔗糖和葡萄糖液體。其他試驗試劑：0.22微米微孔濾膜過濾除菌，該試劑需要現(xiàn)配現(xiàn)用，酶液用對應穩(wěn)滲劑配制酶濃度（W/V，重量體積比）1.0%的蝸牛酶，纖維素酶與混合酶（蝸牛酶∶纖維素酶=1∶1）。Cellulase（MP Biomedical）及Snailase（Wolsen）等為國產分析純。

1.2 試驗方法

原生質體數(shù)量統(tǒng)計：利用血球板進行計數(shù)，首先將原生質體稀釋至108，涂至平板上，然后按照公式：原生質體產量（個/毫升）=每格平均原生質體數(shù)×400×稀釋倍數(shù)×104進行計算。

原生質體再生率（%）=[(再生平板菌落數(shù)-CK板菌落數(shù)）×稀釋倍數(shù)]/（涂布體積×原生質體濃度）×100

方案設計：選取7個外部環(huán)境因素，考察這7 個外部環(huán)境因素對香菇原生質體的產量以及再生率的具體影響。詳情見表1。

表1 單因素試驗設計

2 結果與分析

2.1 不同種類裂解酶原生質體產量與再生率的影響

如圖1所示，混合酶的酶解效果要比單一酶所產生的酶解效果好一些，混合酶作為酶解介質時，單位時間內原生質體的產量最高能達5.69×108個/毫升，此產量是蝸牛酶作為酶解介質原生質體產量的1.42倍，是纖維素酶作為酶解介質產量的4.15倍；混合酶作為酶解介質時，原生質體再生率是0.91%，蝸牛酶作為酶解介質的原生質體再生率為0.9%，達到了纖維素酶作為酶解介質時原生質體再生率的2.39倍。產生如此大差異的原因是，香菇自身的菌絲細胞壁組成成分比較復雜，因此，需要不同種類的酶共同作用，才能對其產生較好的降解作用。在此組試驗中，蝸牛酶是包含了淀粉酶、蛋白酶等20多種不同種類的酶于一體。因此，其酶解效果與混合酶一樣能夠較好的刺激原生質體的再生，但是纖維素酶成分比較單一，故而對原生質體的酶解效果一般。綜上研究，在后續(xù)的多因素試驗中會優(yōu)先選擇混合酶作為介質。

圖1 不同酶種類對原生質體產量與再生率的影響

圖2 酶解時間對原生質體產量與再生率的影響

2.2 酶解時間對原生質體產量與再生率的影響

通過圖2可以看出，酶解時間在3小時之內時，原生質體再生率與時間呈正相關的關系，隨著時間的增加，原生質體的產量也不斷增加。之后，原生質體的再生率則會出現(xiàn)下降。在整個酶解過程中原生質體產量從2小時后明顯上升，2.5小時后逐漸下降?；貧w分析后，可知酶解時間為2.82小時，原生質體再生率達到頂點1.7%；酶解時間為3.44小時，原生質體產量達到最高2.27×108個/毫升。

2.3 酶解溫度對原生質體產量與再生率的影響

原生質體的產量及再生率受溫度影響效果明顯，其中30℃是原生質體產量變化的臨界點，在這之前原生質體產量醉著溫度升高而增加，之后則出現(xiàn)明顯的下降。經(jīng)過回歸方程計算可以得出，原生質體再生率在30℃達到最高，為1.08%，原生質體產量在29℃達到最高，為4.06×108個/毫升。分析其他酶解介質可以得出，蝸牛酶的最適酶解溫度范圍是30～37℃，纖維酶的最適酶解溫度為35℃左右，當溫度處于最適酶解溫度時，其對于菌絲體細胞壁的酶解效果最好。因此，菌絲的細胞壁分解效率較高。而對于混合酶來說，雖然在35℃時酶活性較高，但是較高的溫度會擾亂菌絲的內部代謝，影響細胞體內部穩(wěn)定性，最終影響原生質體的產生。因此，當溫度高于30℃，原生質體的再生率和產量均出現(xiàn)了明顯下降。

2.4 菌齡對原生質體產量與再生率的影響

試驗結果如圖3，當菌齡低于4天，隨著菌齡的增加，原生質體的產量也會增加，當菌齡高于4天時，隨著菌齡的增加，原生質體的再生率逐步降低；當菌齡大于6天時，原生質體再生率急速下降。經(jīng)過回歸方程計算可以得出：原生質體再生率在5.4天時達到最高，約為2.07%；原生質體的產量在4.1天時達到頂點，為2.01×108個/毫升。

2.5 穩(wěn)滲劑種類對原生質體制備產量與再生率的影響

圖4可以看出，當選取甘露醇作為滲穩(wěn)劑時，原生質體的產量最高但是再生率很低，當使用硫酸鎂作為穩(wěn)滲劑時，原生質體的產量排名第三，僅處于甘露醇和葡萄糖作為滲穩(wěn)劑之后；硫酸鎂的再生率為1.73%，葡萄糖的再生率為1.60%，此再生率僅次于用蔗糖當作穩(wěn)滲劑的再生平板，蔗糖的再生率為1.94%。由于在制備原生質體時，使用硫酸鎂當作穩(wěn)滲劑，不但能夠較好的維持菌絲體細胞膜內外滲透壓的穩(wěn)定性，同時滲穩(wěn)劑中的Mg2+也能夠通過交聯(lián)羧基和磷脂質實現(xiàn)維持細胞膜穩(wěn)定的作用。但是Mg2+的供能能力較差，難以維持細胞壁再生所需要的能量，同理單糖也無法實現(xiàn)此項需求。因此，想要實現(xiàn)原生質體再生率最大化，應該選用硫酸鎂作為制備滲穩(wěn)劑，蔗糖作為再生滲穩(wěn)劑。

2.6 穩(wěn)滲劑濃度對原生質體產量與再生率的影響

圖5可以看出，滲穩(wěn)劑濃度對于原生質體的產量和再生率都能產生影響，當使用純凈水作為參照時，目標菌絲的原生質體產量是4.2×107個/毫升，原生質體的再生率為0。在此基礎上不斷加大滲穩(wěn)劑的濃度，可以看出原生質體的產量和再生率均呈現(xiàn)先增大后減小的變化。通過觀察試驗曲線可以發(fā)現(xiàn)，當滲穩(wěn)劑濃度低于0.2摩爾/升時，隨著濃度增加，原生質體再生率提升明顯，此后隨著濃度增加原生質體再生率無明顯變化；經(jīng)過回歸方程計算：當滲穩(wěn)劑濃度為0.51摩爾/升時，原生質體產量達到最高1.85×108個/毫升，當穩(wěn)滲劑的濃度為0.33摩爾/升的時候，原生質體的再生率會達到最大值為1.97%。

2.7 pH對原生質體產量與再生率的影響

圖3 菌齡對原生質體產量與再生率的影響

圖4 穩(wěn)滲劑種類對原生質體產量與再生率的影響

圖5 穩(wěn)滲劑濃度對原生質體產量與再生率的影響

圖6 pH對原生質體產量與再生率的影響

通過觀察下圖6，可以發(fā)現(xiàn)當滲穩(wěn)劑pH處于3～4時，原生質體的產量基本上是穩(wěn)定沒有變化，原生質體的再生率為0；當處于4～5時，對于原生質體的產量和再生率都有顯著的提升刺激；當處于5～7時，原生質體的產量與再生率都會出現(xiàn)不同程度的下降，回歸分析后得出，當pH為5.10時，原生質體的產量可達到最大值，為2.34×108個/毫升，當pH為5.69時，原生質體的再生率可達到最大值，為1.86%。

3 小結與討論

供給試驗使用的幾種因素在固定限度之中時，都能夠提升原生質體的產量以及再生率，并且具有明顯的效果。原生質體的最佳制備條件為，在pH為5.0的條件下，使用0.5摩爾/升硫酸鎂作為穩(wěn)滲劑，在溫度達到28℃的時候對5日齡菌絲進行酶解3小時。最佳再生條件為，在pH為5.5的條件下，使用0.5摩爾/升蔗糖作為穩(wěn)滲劑，在溫度達到27.8℃的時候對6.5日齡菌絲進行酶解2.9小時。

酶活和酶解的反應時間將會決定原生質體的產量大小，各種因素對原生質體的產量所造成的影響效果由小到大依次為，滲穩(wěn)劑、菌齡、酶解時間、酶解溫度。同時，酶活性受到酶解液pH和酶解溫度的影響，進而影響原生質體產量。當pH為4.5～6.0范圍內，則45～55℃為纖維素酶的最適宜溫度，30～37℃為蝸牛酶的最適宜溫度，酶促反應的快慢與酶活性成正相關關系；同時混合酶的酶解效果要比單一酶效果顯著；在單位時間內，混合酶產生的原生質體的數(shù)量要大于單一酶所產生的原生質體的數(shù)量。

原生質體活性的大小可直接決定原生質體再生率的大小，本次研究中選取的各項因素對于原生質體再生率影響效果由小到大分別是，酶解溫度、菌齡、酶解時間、滲穩(wěn)劑濃度。滲穩(wěn)劑的濃度過大會導致原生質體失水失活、滲穩(wěn)劑濃度過小會導致原生質體脹破，這都會影響原生質體的再生率。當反應酶處于其適宜反應條件時，酶解的反應比較快速，因為混合酶系能夠對各種各樣的底物進行酶解反應，但是，隨著酶解時間不斷增加，原生質體膜暴露時間過長會導致其細胞壁再生率下降。因此，原生再生率也將會減弱。溫度為（25±1）℃時，是香菇菌絲和原生質體的最佳生長溫度，過高或者過低均會影響再生率。