金前躍，王寅彪，柴永笑，盧清俠，李 鵬，郭振華，邢廣旭，鄧瑞廣，張改平,7

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002； 2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中英禽病國(guó)際研究中心，河南 鄭州 450002； 3.江蘇高校動(dòng)物重要疾病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009； 4.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 公共衛(wèi)生學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003； 5.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712100； 6.新鄉(xiāng)學(xué)院 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；7.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002)

禽腺病毒(Fowl adenovirus，F(xiàn)AdV)屬于腺病毒科(Adenoviridae)、禽腺病毒屬(Aviadenovirus)，分為A、B、C、D、E等5個(gè)種，12個(gè)血清型(1～8a、8b～11)[1]。其中，F(xiàn)AdV-1型屬于A種，F(xiàn)AdV-5型屬于B種，F(xiàn)AdV-4型和FAdV-10型屬于C種，F(xiàn)AdV-2、FAdV-3、FAdV-9、FAdV-11型屬于D種，F(xiàn)AdV-6、FAdV-7、FAdV-8a、FAdV-8b型屬于E種。FAdVs可感染雞、鴨、鵝、鴿子、鵪鶉和鴕鳥(niǎo)等禽類群體，一般僅造成亞臨床癥狀，致病性較強(qiáng)的FAdVs可引起心包積水綜合征(HPS)、雞包涵體肝炎(IBH)和肌胃糜爛(GE)等[2-4]。HPS也稱為肝炎-心包積水綜合征(HHS)，主要由FAdV-4感染引起，剖檢可見(jiàn)淡黃色心包積液或心包內(nèi)出現(xiàn)膠凍狀物質(zhì)和嚴(yán)重的肝炎病變?；疾‰u常突然發(fā)病，迅速死亡，死亡率高達(dá)30%～70%[5]。FAdVs是無(wú)囊膜的雙股線性DNA病毒，基因組全長(zhǎng)在40～46 kb，六鄰體(Hexon)蛋白是病毒表面含量最高的蛋白，富含主要的抗原決定簇，可用于FAdVs的基因分型[6-7]。

2014年以來(lái)，IBH和HPS病例在我國(guó)多個(gè)省份雞群中不斷出現(xiàn)且呈增加趨勢(shì)，對(duì)國(guó)內(nèi)養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大損失[8-9]。ZHAO等[9]從2013年采集的病雞樣品中首次分離到FAdV-4型病毒，命名為JSJ13株。同時(shí)，多項(xiàng)研究表明，國(guó)內(nèi)當(dāng)前流行的FAdV-4變異株感染是引起此次HPS疫情的主要原因[10-11]。與國(guó)外無(wú)毒力的FAdV-4 ON1株和FAdV-4 KR5株相比，國(guó)內(nèi)流行的FAdV-4存在ORF19基因缺失，而且與JSJ13株相比，2015年以來(lái)分離的多株FAdV-4同時(shí)存在ORF29基因的部分缺失，這可能暗示國(guó)內(nèi)的FAdV-4流行株在進(jìn)一步適應(yīng)禽類宿主[12-13]。河南省多個(gè)地市也出現(xiàn)了HPS疫情，流行病學(xué)調(diào)查顯示，5～11周齡雞群發(fā)病率較高，死亡率達(dá)30%～80%[14-15]。為明確FAdV-4河南流行株的基因組特征和分子進(jìn)化關(guān)系，從新鄭某雞場(chǎng)采集了患有HPS的病雞樣品，通過(guò)盲傳分離FAdV毒株，并通過(guò)免疫熒光分析和PCR檢測(cè)確定分離毒株的血清型，對(duì)其進(jìn)行全基因組序列分析和分子進(jìn)化分析，以期為有效防控HPS暴發(fā)及FAdV感染在河南省的流行奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

DME/F12培養(yǎng)基購(gòu)自HyClone公司；青鏈霉素混合液、胰蛋白酶、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)購(gòu)自Solarbio公司；胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；Premix ExTaqDNA聚合酶、病毒基因組提取試劑盒(MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0)購(gòu)自Takara公司；多聚甲醛、Triton X-100均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)；FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG購(gòu)自北京博奧森；FAdV-4特異性單克隆抗體由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院王江教授惠贈(zèng)。

1.2 病料和細(xì)胞

患有HPS的病雞來(lái)源于河南省鄭州市(新鄭)某雞場(chǎng)。解剖后，收集心臟、肝臟、肺臟等組織，凍存于-40 ℃冰箱。雞肝癌細(xì)胞系(LMH)由本實(shí)驗(yàn)室保存，利用含10%胎牛血清的DME/F12培養(yǎng)基于含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3 病料的處理

無(wú)菌條件下取適量病料，以1∶3的質(zhì)量體積比加入含青鏈霉素的無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(PBS)徹底研磨。將組織研磨液收集于無(wú)菌Eppendorf管中，在-80 ℃和室溫間反復(fù)凍融3次，10 000 r/mim離心15 min，使用0.22 μm的濾器過(guò)濾上清液，凍存于-80 ℃。

1.4 病毒的分離

在LMH細(xì)胞匯合度約達(dá)到80%時(shí)，棄去培養(yǎng)基并用無(wú)菌PBS洗滌3次。使用無(wú)血清DME/F12培養(yǎng)基將上述處理后的病料研磨液稀釋50倍后接種于細(xì)胞上，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1.5 h。然后棄去病毒液，加入含2%胎牛血清的DME/F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)72 h。之后通過(guò)-80 ℃與室溫間反復(fù)凍融，2 000 r/min離心15 min，收集病毒液。過(guò)濾后，再次接種于LMH細(xì)胞，盲傳3代以分離獲得病毒，并將其繼續(xù)傳至第11代以獲得穩(wěn)定毒株。

1.5 病毒的鑒定

1.5.1 細(xì)胞病變 制備LMH單細(xì)胞懸液并將其稀釋至約1.0×105個(gè)/mL，向96孔細(xì)胞培養(yǎng)板各孔中加入100 μL上述懸液于含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。至細(xì)胞匯合度約為80%時(shí)，棄去培養(yǎng)基并使用無(wú)菌PBS洗滌后，向各孔中接種100 μL病毒液。孵育1.5 h后，棄去病毒液，加入含2%胎牛血清的DME/F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每24 h觀察細(xì)胞病變。

1.5.2 免疫熒光檢測(cè) 按照1.5.1中的方法將盲傳獲得的病毒接種至LMH細(xì)胞，以未接毒的LMH細(xì)胞作為對(duì)照，24 h后，棄掉細(xì)胞上清，用預(yù)冷的PBS洗滌3次。使用4%多聚甲醛在室溫下固定細(xì)胞30 min，PBS洗滌2次，之后加入100 μL的0.1% Triton X-100室溫作用2 min，棄Triton X-100溶液，各孔加滿含5%脫脂奶粉的封閉液于4 ℃封閉過(guò)夜。PBS洗滌3次，加入抗FAdV-4的特異性單克隆抗體(1∶100)，37 ℃孵育1 h。PBS洗滌3次，加入FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG (1∶100)，37 ℃孵育1 h。PBS洗滌3次，加入DAPI (1∶1 000)對(duì)核酸進(jìn)行染色。然后再次洗滌，加入100 μL PBS防止干燥，并使用熒光顯微鏡觀察。

1.5.3 PCR檢測(cè) 根據(jù)FAdV-4 MX-SHP95毒株(GenBank登錄號(hào)：KP295475.1)的DNA聚合酶基因序列設(shè)計(jì)引物。PCR上游引物序列為5′-GCAGCGTGGTCTTGAAGATGGTTC-3′，下游引物序列為5′-CGCATTCAAGCCCGTTCGATTC-3′，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為632 bp。PCR反應(yīng)條件：頂蓋溫度99 ℃，預(yù)變性95 ℃ 5 min；變性95 ℃ 30 s，退火58 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 40 s，循環(huán)30次；72 ℃延伸10 min，4 ℃停止反應(yīng)。采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。

1.5.4 全基因組測(cè)序 按照病毒基因組提取試劑盒說(shuō)明，提取FAdV-4毒株的全基因組，由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行全基因組二代測(cè)序。

1.6 分子進(jìn)化分析

將分離株的全基因組序列和Hexon基因序列與GenBank中相關(guān)序列進(jìn)行比對(duì)。利用MegAlign軟件的View/Sequence distance功能分析分離株與其他FAdV毒株的全基因組序列相似性，利用Mega 6.06軟件中的Clustal W程序完成分離株全基因組序列比對(duì)，并采用鄰接法構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(shù)，步長(zhǎng)值(Bootstrap value)設(shè)置為1 000。利用DNAStar軟件對(duì)相關(guān)毒株的Hexon蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離毒株細(xì)胞病變觀察

正常LMH細(xì)胞形態(tài)為梭形，呈單層貼壁生長(zhǎng)(圖1A)。病料研磨液接種24 h后，部分細(xì)胞出現(xiàn)變圓的病變狀態(tài)(圖1B)；接種后48 h，幾乎所有的細(xì)胞都出現(xiàn)病變，呈葡萄串珠狀聚在一起(圖1C)；72 h后，病變的細(xì)胞大量脫落，部分細(xì)胞崩解，培養(yǎng)基變渾濁(圖1D)；說(shuō)明分離的病毒能夠感染LMH細(xì)胞并產(chǎn)生明顯的細(xì)胞病變。

A:正常細(xì)胞; B:接種后24 h; C:接種后48 h; D:接種后72 hA:Normal cells; B:24 h after inoculation; C:48 h after inoculation; D:72 h after inoculation

2.2 分離毒株免疫熒光檢測(cè)結(jié)果

免疫熒光檢測(cè)結(jié)果表明，分離毒株感染LMH細(xì)胞24 h后，能在細(xì)胞質(zhì)中觀察到綠色熒光信號(hào)，而對(duì)照組沒(méi)有熒光信號(hào)(圖2)，進(jìn)一步說(shuō)明病毒成功適應(yīng)了LMH細(xì)胞，并獲得了良好增殖。

A:病毒感染的LMH細(xì)胞; B:未感染的LMH細(xì)胞A:Virus-infected LMH cells; B:Mock-infected LMH cells

2.3 分離毒株P(guān)CR鑒定結(jié)果

將處理過(guò)的病料研磨液接種LMH細(xì)胞，收集1～11代病毒液進(jìn)行PCR檢測(cè)后，均擴(kuò)增得到了632 bp大小的條帶(圖3)。表明成功分離了1株FAdV，命名為FAdV ZZ株。

M:DL2000 DNA Marker; 1—11:1～11代收集的病毒液; 12:陽(yáng)性對(duì)照; 13:陰性對(duì)照M:DL2000 DNA Marker; 1—11:Virus from the different passages(1—11); 12:Positive control; 13:Negative control

2.4 分離毒株全基因組序列分析

本研究分離的FAdV ZZ株(GenBank登錄號(hào)：MN337322.1)的基因組全長(zhǎng)為43 725 bp，GC含量為54.87%?；谌蚪M序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析表明該分離株為禽腺病毒C亞群血清4型，命名為FAdV-4 ZZ株(圖4)。與無(wú)毒力的FAdV-4 ON1和FAdV-4 KR5株相比，F(xiàn)AdV-4 ZZ株存在ORF19、ORF27和ORF30基因的缺失，F(xiàn)AdV-4 ZZ株與ON1株和KR5株的核苷酸序列相似性分別為98.45%和98.77%。FAdV-4 ZZ株與國(guó)內(nèi)首次分離的JSJ13株相比，ORF29序列存在33個(gè)堿基缺失，表明我國(guó)不同地區(qū)流行的FAdV-4毒株在序列上存在差異。

圖4 FAdVs的全基因組分子進(jìn)化分析Fig.4 The genome-wide phylogenetic analysis of FAdVs

2.5 分離毒株Hexon基因的分子進(jìn)化分析

FAdV-4 ZZ株的Hexon蛋白含937個(gè)氨基酸?；贖exon基因的分子進(jìn)化分析同樣表明該分離株為禽腺病毒C亞群血清4型(圖5)。FAdV-4 ZZ株的Hexon基因與國(guó)內(nèi)流行的CH/JSXZ/2015和SDSX1株的核苷酸序列相似性均為100%；與ON1株和KR5株的Hexon基因核苷酸序列相似性分別為98.69%和98.90%。FAdV-4 ZZ株的Hexon蛋白與國(guó)內(nèi)流行的CH/JSXZ/2015株和SDSX1株的氨基酸序列完全一致，與ON1株和KR5株的Hexon蛋白氨基酸序列分別存在13個(gè)和12個(gè)氨基酸突變，可能對(duì)其抗原表位和免疫原性產(chǎn)生影響(表1)。

圖5 FAdVs Hexon基因的分子進(jìn)化分析Fig.5 Phylogenetic analysis of FAdVs Hexon gene

表1 Hexon蛋白氨基酸序列的比對(duì)Tab.1 Alignment of amino acids of Hexon protein of FAdV-4 ZZ

3 結(jié)論與討論

1987年，雞心包積水綜合征(HPS)在巴基斯坦的安卡拉地區(qū)首次被報(bào)道，因此它也被稱為“安卡拉”病，隨后該病出現(xiàn)在印度、墨西哥、俄羅斯、韓國(guó)、日本等國(guó)家[16]。2007—2013年，IBH和HPS病例在我國(guó)以散發(fā)為主，但2014年以來(lái)，國(guó)內(nèi)雞群HPS病例迅速增加[3]。研究表明，F(xiàn)AdV-4變異株感染是引起此次HPS疫情的主要原因[10-11]。河南省是家禽養(yǎng)殖大省，HPS疫情對(duì)全省的家禽養(yǎng)殖造成了嚴(yán)重影響。深入研究FAdV-4病毒的基因組特征和分子進(jìn)化關(guān)系對(duì)有效防控FAdV-4感染和HPS暴發(fā)具有重要意義。

基于全基因組序列和Hexon基因的分子進(jìn)化分析均表明，該分離株為FAdV-4。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AdV-4 ZZ株可以使LMH細(xì)胞產(chǎn)生明顯的病變，并可在該細(xì)胞系上穩(wěn)定傳代。與無(wú)毒力的ON1株和KR5株相比，F(xiàn)AdV-4 ZZ株以及國(guó)內(nèi)流行的JSXZ-2015、JSJ13株和SDSX1株均存在ORF19、ORF27、ORF30基因缺失。ORF19基因編碼病毒的脂肪酶(Lipase)，研究推測(cè)國(guó)外流行株FAdV-4 SHP95的高致病性可能與ORF19基因被終止密碼子打斷有關(guān)[17]。國(guó)內(nèi)FAdV-4流行株是否因ORF19基因缺失而使毒力增強(qiáng)有待進(jìn)一步研究。FAdV-4 ZZ株以及CH/JSXZ/2015株和SDSX1株與國(guó)內(nèi)首次分離的JSJ13株相比，ORF29序列均存在33個(gè)堿基缺失，表明我國(guó)不同地區(qū)流行著含有2種不同ORF29序列的FAdV-4毒株，目前尚不清楚這一基因缺失對(duì)FAdV-4毒株復(fù)制和致病力的具體影響。Hexon蛋白是FAdV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，具有血清型特異性，含有中和性抗原表位[6,18]。FAdV-4 ZZ株的Hexon蛋白與國(guó)內(nèi)流行的JSXZ-2015株和SDSX1株的氨基酸序列完全一致，與ON1株和KR5株的Hexon蛋白氨基酸序列分別存在13個(gè)和12個(gè)氨基酸突變，這些變異對(duì)Hexon蛋白抗原表位和免疫原性的影響有待研究。

2014年以來(lái)，HPS疫情在我國(guó)多個(gè)省份出現(xiàn)，對(duì)養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大損失。研究發(fā)現(xiàn)，從商品化的新城疫弱毒苗中可以分離出FAdV-4型病毒，這可能是FAdV感染在國(guó)內(nèi)雞群中大面積流行的原因之一[19]。此外，除了FAdV-4型，我國(guó)部分地區(qū)也流行著FAdV-8b、FAdV-10、FAdV-11等血清型[20-21]。可見(jiàn)，當(dāng)前防控FAdV感染的形勢(shì)較為嚴(yán)峻。分析國(guó)內(nèi)FAdV流行株的基因組特征和分子進(jìn)化關(guān)系，對(duì)于有效防控FAdV感染和HPS暴發(fā)具有重要價(jià)值。本研究對(duì)FAdV-4 ZZ株的分離及全基因組序列測(cè)定明確了FAdV-4河南流行株和國(guó)內(nèi)外流行株的進(jìn)化關(guān)系，為建立FAdV-4特異性檢測(cè)方法和疫苗研究奠定了基礎(chǔ)。