唐芬芬，楊偉克

(1.紅河學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 蒙自 661101；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蠶桑蜜蜂研究所，云南 蒙自 661101)

堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)是一類廣泛存在于生物體且相對(duì)保守的非特異性磷酸水解酶，它在堿性條件下不僅能催化磷酸酯的水解，生成無機(jī)磷及相應(yīng)產(chǎn)物，而且參與了磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移和代謝[1-2]。ALP不僅在昆蟲的生長(zhǎng)發(fā)育、神經(jīng)傳導(dǎo)、物質(zhì)代謝和滯育等過程發(fā)揮了重要作用，而且與昆蟲的抗性密切相關(guān)[3]。有機(jī)磷處理云杉色卷蛾，其ALP基因表達(dá)量及酶活性會(huì)顯著增加，蟲體的抗性增強(qiáng)[4]。用菊酯類殺蟲劑處理赤擬谷盜，ALP酶活性在處理24 h后顯著增加[5-6]。棉鈴蟲ALP酶活性大小能夠影響其對(duì)含有機(jī)磷農(nóng)藥的水解[7]。另外對(duì)除蟲菊酯類殺蟲劑具有抗性的棉鈴蟲品系，其ALP酶活性顯著高于敏感品系[8]。

蛻皮激素20E能誘導(dǎo)昆蟲發(fā)生蛻皮，保幼激素JH通過抑制蛻皮激素的作用以維持昆蟲的生長(zhǎng)狀態(tài)[9-10]。兩類激素的滴度在幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育過程中交替上調(diào)，協(xié)同調(diào)控了昆蟲的蛻皮與變態(tài)[11-12]。在對(duì)甜菜夜蛾的研究中發(fā)現(xiàn)，蛻皮激素20E能夠激活馬氏管ALP酶活性，而JH可以促進(jìn)中腸和盲腸的ALP酶活性[13-14]。用JH處理雌性果蠅會(huì)降低ALP酶活性及多巴胺DA的含量，而20E處理能顯著增加ALP酶活性及DA的含量[15]。

家蠶(Bombyxmori)作為一種重要的特種經(jīng)濟(jì)昆蟲，飼育簡(jiǎn)單，蠶桑產(chǎn)業(yè)已成為我國農(nóng)民提高經(jīng)濟(jì)收入的重要來源[16]。研究發(fā)現(xiàn)，質(zhì)型多角體病毒(Cytoplasmicpolyhedrosisvirus，CPV)和蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis，Bt)感染家蠶早期，ALP酶活性會(huì)增強(qiáng)，而感染后期，由于中腸組織受到一定程度的損傷，其ALP酶活性急劇降低，暗示ALP可能參與了家蠶的免疫防御過程[17-18]。ALP酶活性是衡量家蠶生理狀況和經(jīng)濟(jì)價(jià)值的一項(xiàng)重要生化指數(shù)，激活A(yù)LP酶活性不僅能增強(qiáng)蠶體的抗逆性，而且有助于提高蠶絲產(chǎn)量和質(zhì)量[19]。家蠶機(jī)體的ALP酶活性在每個(gè)齡期餉食后逐漸升高，盛食期最高，入眠時(shí)急劇降低[20]。食桑階段，蠶體20E含量維持在一個(gè)較低的水平，而JH含量會(huì)逐漸增加；進(jìn)入眠期，20E含量逐漸增加，JH含量降低，這暗示兩類激素的變化規(guī)律與蠶體ALP酶活性變化規(guī)律存在一定的關(guān)聯(lián)，而關(guān)于昆蟲激素20E和JH對(duì)家蠶ALP酶活性的影響及其編碼基因表達(dá)調(diào)控的研究相對(duì)較少。鑒于此，以鱗翅目模式昆蟲家蠶為研究對(duì)象，探析昆蟲激素對(duì)家蠶ALP基因的表達(dá)調(diào)控作用及對(duì)其ALP酶活性的影響，旨在為篩選和培育強(qiáng)健性多絲量家蠶新品種提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料

供試家蠶品種為大造，飼育條件：恒溫培養(yǎng)箱26 ℃，相對(duì)濕度(75±5)%，光照周期(12 h光照和12 h黑暗)，新鮮桑葉飼育。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 主要儀器 恒溫培養(yǎng)箱購自廣州深華生物技術(shù)有限公司；Tana 1220成像系統(tǒng)購自上海天能科技有限公司；普通PCR擴(kuò)增儀和熒光定量PCR儀均購自美國ABI公司；Bio Tek Synergy多功能酶標(biāo)儀購自美國伯騰儀器有限公司。

1.2.2 主要試劑 動(dòng)物組織總RNA抽提試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司)；熒光定量試劑SYBR Green Master Mix(上海翊圣生物科技有限公司)；蛻皮激素20E和保幼激素JH(Sigma公司)；BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒(Beyotime公司)；ALP酶活性測(cè)定試劑盒(南京建成生物有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 激素處理試驗(yàn)及樣品采集 參考胡啟豪等[21]的方法，用二甲基亞砜(DMSO)分別溶解保幼激素JH(質(zhì)量濃度0.5 g/L)和蛻皮激素20E(質(zhì)量濃度1.0 g/L)。選取家蠶五齡第3天發(fā)育良好的幼蟲，用微量注射器在每頭家蠶幼蟲腹部分別注射4 μL的JH和20E，以注射等量的0.1% DMSO為對(duì)照組。在注射3 h、6 h、12 h、24 h和48 h后，冰上解剖家蠶幼蟲，取血淋巴和中腸組織，每次取樣均設(shè)4次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)取6頭蠶，樣品收集后置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 酶活性測(cè)定 取適量家蠶血淋巴，在4 ℃條件下4 500 r/min離心15 min，收集上清液，即為待測(cè)酶液。家蠶中腸組織，用生理鹽水清洗干凈，置于玻璃勻漿器中勻漿5 min，4 ℃條件下3 500 r/min離心10 min，上清液即為待測(cè)酶液。按照BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒和ALP酶活性測(cè)定試劑盒說明書，分別測(cè)定蛋白質(zhì)含量和酶活性。

1.3.3 總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄 根據(jù)動(dòng)物組織總RNA抽提試劑盒操作說明，提取家蠶中腸和血淋巴總RNA，用分光光度計(jì)測(cè)定OD260/OD280的值，計(jì)算RNA樣品濃度。取OD260/OD280在1.9～2.0的樣品，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 以真核翻譯起始因子4A基因(家蠶芯片探針I(yè)D：Sw22934)為熒光定量?jī)?nèi)參基因，家蠶ALP基因(NCBI登錄號(hào)：NM_001044071)為靶標(biāo)基因，利用Primer Premier 5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)定量引物。由生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物，序列見表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物Tab.1 Primers used in quantitative real-time PCR

參照熒光定量試劑SYBR Green Master Mix操作說明進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。反應(yīng)體系20 μL，擴(kuò)增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；65 ℃ 5 s，(然后每次加0.5 ℃，直到95 ℃，5 s)。采用ABI公司StepOne熒光定量PCR擴(kuò)增儀記錄試驗(yàn)結(jié)果，每個(gè)樣品均設(shè)4次重復(fù)，根據(jù)公式

2-△△CT計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及作圖，數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，利用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 20E和JH對(duì)家蠶血淋巴和中腸ALP基因表達(dá)量的影響

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)了20E和JH處理后家蠶中腸和血淋巴ALP基因的相對(duì)表達(dá)量，將對(duì)照組ALP基因的相對(duì)表達(dá)量設(shè)定為1，處理組基因的相對(duì)表達(dá)量若大于1，表明該基因上調(diào)表達(dá)，若小于1則該基因下調(diào)表達(dá)，結(jié)果見圖1。圖1A結(jié)果表明，家蠶血淋巴的ALP基因在20E處理6 h、12 h和24 h均明顯上調(diào)表達(dá)，其中在處理6 h表達(dá)量最高，約為處理組的2.3倍，而在處理3 h和48 h基因的相對(duì)表達(dá)量無明顯變化，其相對(duì)值都是約等于1。中腸組織的ALP基因在3 h和6 h的相對(duì)表達(dá)量無變化，而在12 h和24 h顯著上調(diào)表達(dá)，相對(duì)表達(dá)量分別為對(duì)照組的2.8倍和2.2倍，在48 h基因表達(dá)量減弱至對(duì)照組水平。圖1B結(jié)果顯示，JH處理家蠶后，血淋巴和中腸的ALP基因均呈現(xiàn)先逐漸上調(diào)表達(dá)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)量增至最高值，隨后急劇減弱至對(duì)照組水平。其中血淋巴的ALP基因在6～24 h持續(xù)上調(diào)表達(dá)，24 h表達(dá)量最高，約為對(duì)照組的3.7倍；而中腸的ALP基因從12 h才開始上調(diào)表達(dá)，在24 h相對(duì)表達(dá)量最高，約為對(duì)照組的4.7倍。

圖1 20E(A)和JH(B)對(duì)家蠶血淋巴和中腸ALP表達(dá)的影響

2.2 20E處理對(duì)家蠶血淋巴和中腸ALP酶活性影響

用蛻皮激素20E處理五齡第3天家蠶幼蟲，隨著處理時(shí)間的推移，血淋巴和中腸的ALP酶活性變化趨勢(shì)如圖2所示。圖2A結(jié)果顯示，血淋巴的ALP酶活性在20E處理后的6 h、12 h和24 h均顯著高于對(duì)照組，其中在12 h活性最高(為33.34 U/mg)，與對(duì)照組相比，達(dá)到極顯著差異水平(P<0.01)。而中腸ALP酶活性僅在12 h和24 h極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，其活性分別為37.68 U/mg和40.95 U/mg(圖2B)。這表明20E對(duì)家蠶血淋巴和中腸ALP酶活性具有一定的促進(jìn)作用。

與對(duì)照組相比,*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)，下同Compared with the control group,* indicates significantly different (P<0.05) and ** indicates extremely significant (P<0.01),the same below

2.3 JH處理對(duì)家蠶血淋巴和中腸ALP酶活性影響

由圖3結(jié)果可知，保幼激素JH處理家蠶幼蟲，其血淋巴和中腸的ALP酶活性均是在6～24 h持續(xù)高于對(duì)照組，并且差異達(dá)到顯著水平，整體呈現(xiàn)出先升高后減弱的趨勢(shì)。其中血淋巴的ALP酶活性在6 h急劇增至最高值(42.29 U/mg)，隨后開始逐漸減弱，在48 h酶活性接近對(duì)照組(圖3A)。而中腸ALP酶活性從6 h開始逐漸增加，在12 h酶活性升至最高，為46.84 U/mg，在24 h酶活性開始有所降低，但仍極顯著高于對(duì)照組(圖3B)。

圖3 JH處理后不同時(shí)間家蠶血淋巴(A)和中腸(B)ALP酶活性的變化

3 結(jié)論與討論

ALP作為昆蟲機(jī)體一類極其重要的水解酶，在對(duì)內(nèi)源或外源化合物的解毒代謝和對(duì)殺蟲劑的抗性形成中起著重要作用[22]。昆蟲ALP隨著機(jī)體發(fā)育時(shí)期及組織分布的不同，其活性大小也不相同[3]。家蠶血淋巴和中腸ALP酶活性在四齡盛食期活性較高，入眠時(shí)急劇降低，五齡起蠶酶活性逐漸升高，到盛食期活性出現(xiàn)峰值，此后開始減弱，熟蠶期維持一個(gè)相對(duì)較低的活性水平[20]。ALP參與蠶體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝吸收，影響蠶絲蛋白的合成及機(jī)體的抗性[19]。蛻皮激素20E和保幼激素JH是昆蟲機(jī)體最為重要的兩類激素，協(xié)同調(diào)控了昆蟲的蛻皮變態(tài)及生長(zhǎng)發(fā)育[23]。20E和JH對(duì)昆蟲不同組織部位堿性磷酸活性的影響并不一致，20E僅能激活甜菜夜蛾馬氏管的ALP酶活性，而JH對(duì)其中腸、盲腸和馬氏管等組織均有激活作用[13-14]。

本研究結(jié)果顯示，昆蟲激素20E和JH均能誘導(dǎo)家蠶血淋巴和中腸ALP基因在一定的時(shí)間范圍內(nèi)出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，并且ALP的酶活性也顯著高于對(duì)照組。血淋巴和中腸的ALP基因?qū)?0E和JH響應(yīng)的時(shí)間存在一定的差異，其中血淋巴的ALP基因是在2種激素處理6 h開始上調(diào)表達(dá)，而中腸組織是在12 h出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)。通過微量注射器在家蠶幼蟲腹部注射20E或JH，激素最先進(jìn)入血淋巴，并隨著血淋巴的循環(huán)流動(dòng)，被運(yùn)送至蠶體其他部位，所以血淋巴ALP基因?qū)に氐捻憫?yīng)略早于中腸。另外，在激素注射的6～24 h，ALP及其編碼基因受到外源激素的調(diào)控，而隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，激素逐漸被消耗代謝，基因的表達(dá)及其酶活不再受其影響，逐漸恢復(fù)到對(duì)照組水平。JH和20E對(duì)家蠶ALP編碼基因表達(dá)水平的影響與其對(duì)ALP酶活性的影響表現(xiàn)一致，提示ALP在家蠶蛻皮變態(tài)過程發(fā)揮了重要作用。20E或JH可通過作用于基因啟動(dòng)子區(qū)域相應(yīng)的調(diào)控元件，進(jìn)而調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)[24]，而ALP基因上游調(diào)控序列是否存在激素應(yīng)答原件有待進(jìn)一步深入探究。