丁培輝，王雁林，勞凱雪

(濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，山東 濱州 256600)

Nesfatin-1首次被發(fā)現(xiàn)是在2006年，日本學(xué)者Oh-I和他的同事在大鼠體內(nèi)實驗中，證實了它是一種與黑皮質(zhì)素蛋白相關(guān)的飽腹感分子。在接下來的研究中，Nesfatin-1被發(fā)現(xiàn)在低級到高級多種動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周組織中都有表達(dá)，且存在多種生物學(xué)效能。但Nesfatin-1與生殖系統(tǒng)關(guān)系研究較少，本文就Nesfatin-1與生殖各相關(guān)方面進(jìn)行綜述，著重探索Nesfatin-1與卵巢顆粒細(xì)胞增殖凋亡的關(guān)系。

1 Nesfatin-1

1.1 Nesfatin-1起源

Nesfatin-1是由日本群馬大學(xué)Oh-I等人最早提出，是由核組蛋白2(nucleobindin2，NUCB2)衍生而來的一種前體神經(jīng)肽，基因編碼為NEFA，它可以通過前激素酶裂解成3個不同的小分子片段，即Nesfatin-1、Nesfatin-2、Nesfatin-3[1]。大鼠實驗中分別將這三種片段注入大鼠側(cè)腦室，間隔一段時間后發(fā)現(xiàn)注入Nesfatin-1的大鼠體重明顯減輕，并且攝食量隨著劑量增加而減少，Nesfatin-2和Nesfatin-3則沒有此明顯作用。繼而，不少學(xué)者將Nesfatin-1作為一種調(diào)節(jié)飲食的多肽類激素進(jìn)行研究。

1.2 Nesfatin-1分子結(jié)構(gòu)

Nesfatin-1的NUCB2含有兩種組份，分別為24個氨基酸(amino acids，aa)的信號肽和396個aa的蛋白質(zhì)，此核組蛋白基因位于11p15.1，包括13個內(nèi)含子和14個外顯子。外顯子3和5之間的基因編碼為Nesfatin-1(見圖1)，通過特異的激素原轉(zhuǎn)化酶PC1發(fā)揮作用后，NUCB2可以在特定的氨基酸位點被剪切形成3個小片段，即Nesfatin-1(1-82aa)、Nesfatin-2(85-163aa)和Nesfatin-3(166-396aa)。雖然Nesfatin-1分子看似結(jié)構(gòu)復(fù)雜，但研究發(fā)現(xiàn)其在各級哺乳動物間具有高度同源性(見圖2)。豬體內(nèi)Nesfatin-1特異性的序列位點探針，測定Nesfatin-1在豬、大鼠和人體內(nèi)的蛋白質(zhì)氨基酸序列，結(jié)果顯示Nesfatin-1在豬、大鼠和人體內(nèi)有多段特異性保守序列，而且呈現(xiàn)出高度同源性(見圖3)。也許正是存在這種物種間的高度同源性，才會導(dǎo)致Nesfatin-1在不同級別的動物間表達(dá)及功能類似。

圖1 NUCB2的基因結(jié)構(gòu)

圖2 NUCB2在不同物種間的高度同源性

圖3 豬、大鼠、人類的Nesfatin-1蛋白序列

2 Nesfatin-1定位與表達(dá)

2.1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)

Nesfatin-1在大鼠、豬、犬和人類等各級動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)均有表達(dá)，經(jīng)研究證實在中樞神經(jīng)系統(tǒng)常表達(dá)于下丘腦外側(cè)區(qū)、室旁核、視上核、弓狀核、孤束核、動眼神經(jīng)副核、藍(lán)斑等區(qū)域[1]。Nesfatin-1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表達(dá)發(fā)揮著控制整個機(jī)體的作用，任何中樞部位異常都會影響Nesfatin-1效能，可能會伴發(fā)相關(guān)疾病。

2.2在消化系統(tǒng)表達(dá)

胃被認(rèn)為是Nesfatin-1最初在消化系統(tǒng)表達(dá)的部位，主要是在胃內(nèi)小分泌細(xì)胞自分泌[2]。鼠類、犬、魚、人類胃黏膜中NUCB2mRNA的表達(dá)量大約是腦的10倍；同時Nesfatin-1在大鼠和小鼠的十二指腸腺表達(dá)，但在大鼠小腸或結(jié)腸的其余部分沒有發(fā)現(xiàn)Nesfatin-1明顯表達(dá)的細(xì)胞。似乎Nesfatin-1的表達(dá)存在物種之間的差異，在金魚體內(nèi)，Nesfatin-1在肝臟胃腸道內(nèi)的表達(dá)量最高，而在直腸的表達(dá)量明顯降低；在斑馬魚、犬的肝臟中Nesfatin-1也是高表達(dá)。Nesfatin-1在消化系統(tǒng)的表達(dá)存在部位及物種差異，并且在之后的研究中被廣泛認(rèn)為是在內(nèi)分泌器官和脂肪組織中表達(dá)。

2.3在脂肪組織表達(dá)

依據(jù)現(xiàn)有研究證據(jù)，Nesfatin-1參與飲食、體重調(diào)節(jié)，其被認(rèn)為是一種新發(fā)現(xiàn)的特異性脂肪因子，在體內(nèi)脂肪細(xì)胞中優(yōu)先表達(dá)。有證實在小鼠、犬、人類的脂肪組織中均有NUCB2mRNA和Nesfatin-1蛋白表達(dá)，在小鼠實驗中發(fā)現(xiàn)其通過飲食調(diào)節(jié)誘導(dǎo)肥胖小鼠體內(nèi)的脂肪和循環(huán)蛋白水平增加。在人類體內(nèi)的Nesfatin-1水平與體重指數(shù)的增加呈現(xiàn)出明顯負(fù)相關(guān)趨勢[3]。雖然有的動物脂肪組織中Nesfatin-1蛋白表達(dá)較少，但脂肪組織產(chǎn)生的Nesfatin-1在調(diào)節(jié)攝食和其他物質(zhì)代謝活動中發(fā)揮著不可估量的作用。

2.4在心血管系統(tǒng)表達(dá)

臨床工作中發(fā)現(xiàn)Nesfatin-1會增加患者心率、血壓，影響外周動脈環(huán)磷酸鳥苷(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)的產(chǎn)生；同時在心臟缺血再灌注損傷方面，它也是一種有利的保護(hù)因子[4]。當(dāng)前，在小鼠、犬、金魚的心肌細(xì)胞和骨骼肌，以及斑馬魚的心房和心室都發(fā)現(xiàn)了Nesfatin-1的表達(dá)，在大鼠和人類的心肌細(xì)胞中表達(dá)也已得到證實。Nesfatin-1參與調(diào)節(jié)人類和動物心臟內(nèi)的葡萄糖代謝，在心血管系統(tǒng)的表達(dá)水平受飲食及冠狀動脈健康的影響。人體各系統(tǒng)協(xié)同調(diào)節(jié)體內(nèi)Nesfatin-1水平。

2.5在肺、脾、腎等組織表達(dá)

在小鼠的肺、脾臟和胸腺中，NUCB2mRNA表達(dá)分布較為廣泛，但是，在大鼠肺和脾中未發(fā)現(xiàn)Nesfatin-1表達(dá)，進(jìn)一步說明即使在近物種間Nesfatin-1表達(dá)也存在差異。在犬類脾、腎、膀胱中檢測到NUCB2mRNA少量表達(dá)。另外，難以想象的是，金魚的腎臟、皮膚和眼睛中也有NUCB2mRNA表達(dá)。Nesfatin-1發(fā)揮各種生物學(xué)效能與其分布可能存在一定關(guān)聯(lián)性。

2.6在生殖系統(tǒng)表達(dá)

Nesfatin-1在生殖系統(tǒng)的特異性表達(dá)決定著它在生殖方面的作用，在大鼠、人類和青春期成熟小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)NUCB2mRNA表達(dá)[5]。同樣，在雌鼠生殖器官卵巢卵泡膜細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中也檢測到NUCB2mRNA的表達(dá)。有研究提示，在豬卵巢卵丘細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)Nesfatin-1表達(dá)，但在卵母細(xì)胞中無明顯表達(dá)[6]。在小鼠卵巢顆粒細(xì)胞、卵泡膜細(xì)胞、子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和腺體中NUCB2mRNA均高表達(dá)[7]。通過對小鼠和人胎盤組織的免疫組織化學(xué)檢測分析發(fā)現(xiàn)，Nesfatin-1主要表現(xiàn)在頂葉滋養(yǎng)層巨細(xì)胞、胎盤外區(qū)和胚胎早期海綿滋養(yǎng)層、胞體滋養(yǎng)細(xì)胞、糖原滋養(yǎng)細(xì)胞、迷宮性毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，而且在人類妊娠中，Nesfatin-1在整個妊娠期的合胞體滋養(yǎng)細(xì)胞中均有高表達(dá)[8]。Maher等[9]人研究發(fā)現(xiàn)雌鼠血清中Nesfatin-1水平明顯升高，雌鼠的平均Nesfatin-1水平高于男性，這種性別差異是由男性和女性生殖器官Nesfatin-1受體數(shù)量分布不同導(dǎo)致的。也有研究稱雄雌鼠各組織內(nèi)的Nesfatin-1表達(dá)水平相似，但在生殖器官的表達(dá)不同。

在體內(nèi)Nesfatin-1蛋白主要以不飽和雙向性分子的形式自由擴(kuò)散進(jìn)入血腦屏障，這一特性可能會影響Nesfatin-1在中樞和外周組織的分布。Nesfatin-1表達(dá)是否真正存在分布位置差異、性別差異、物種差異還與評估方法有關(guān)，值得進(jìn)一步研究。值得肯定的是Nesfatin-1在生殖器官的顯著表達(dá)提示該多肽在生殖功能中有一定生理作用。

3 Nesfatin-1與生殖

3.1 Nesfatin-1與下丘腦-垂體-性腺軸

Nesfatin-1可能通過調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-性腺軸，參與生殖成熟和功能的調(diào)節(jié)[9]。Hatef等[10]人發(fā)現(xiàn)，在體外用睪酮處理小鼠的下丘腦和垂體細(xì)胞，監(jiān)測到NUCB2mRNA和蛋白的表達(dá)量增加。Seon等[11]人的研究結(jié)果也證實了被切除睪丸的小鼠垂體中NUCB2mRNA的表達(dá)水平降低，睪丸相關(guān)激素替代治療后表達(dá)上升；而若在下丘腦補(bǔ)充睪酮后，其表達(dá)水平會明顯降低。Maher等[9]人研究發(fā)現(xiàn)切除卵巢后的雌性大鼠，體內(nèi)Nesfatin-1水平顯著下降，如果用雌二醇、黃體酮或兩者合用替代治療后則結(jié)果相反，替代治療后的結(jié)果可能與垂體或生殖器官中NUCB2mRNA表達(dá)量增加有關(guān)。Kim等[7]人給予小鼠注射孕馬血清(pregnant mare serum gonadotropin，PMSG)后，發(fā)現(xiàn)PMSG劑量依賴性地增加了小鼠卵巢和子宮內(nèi)NUCB2mRNA的表達(dá)。由此可見，Nesfatin-1依賴下丘腦-垂體-性腺軸參與生殖內(nèi)分泌活動，并且扮演重要角色。

3.2 Nesfatin-1參與青春期、動情周期的變化

Nesfatin-1在青春期、動情周期不同階段出現(xiàn)規(guī)律性變化。在青春期之前，下丘腦的Nesfatin-1蛋白和NUCB2mRNA的表達(dá)會增加，可能是該分子刺激促性腺激素參與垂體調(diào)節(jié)活動。許多學(xué)者已經(jīng)證實從青春期前到生殖成年的小鼠，睪丸內(nèi)的NUCB2mRNA和蛋白表達(dá)會顯著增加，同時睪丸質(zhì)量和循環(huán)總睪酮水平也會增加；如果使用外源性Nesfatin-1對青春期前小鼠處理可能會增加青春期前小鼠睪丸生長發(fā)育所必需的類固醇激素的產(chǎn)生。Kim等[12]研究發(fā)現(xiàn)卵巢和子宮內(nèi)的NUCB2mRNA和Nesfatin-1蛋白在發(fā)情期最高，發(fā)情間期較低；并受促性腺激素和類固醇激素的調(diào)節(jié)。合適的Nesfatin-1表達(dá)是青春期正常發(fā)育、規(guī)律動情周期的關(guān)鍵。

3.3 Nesfatin-1與多囊卵巢綜合征

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是育齡期女性最常見的內(nèi)分泌紊亂性疾病，也是女性不孕癥的主要原因之一。PCOS的發(fā)生是多因素共同作用的結(jié)果，目前臨床觀點主要認(rèn)為可能與下丘腦-垂體-卵巢軸調(diào)節(jié)功能出現(xiàn)異常等因素有關(guān)。大部分患者伴有肥胖、胰島素抵抗及代償性高胰島素血癥等癥狀，其病因、病理和生理機(jī)制存在眾多難點和疑點，有待于進(jìn)一步探討。綜合文獻(xiàn)分析Nesfatin-1參與葡萄糖等能量代謝及生殖內(nèi)分泌調(diào)節(jié)，可能與PCOS的發(fā)生發(fā)展存在一定的關(guān)聯(lián)。至今，大量關(guān)于PCOS的實驗研究涌現(xiàn)，動物實驗研究中指出PCOS大鼠卵巢組織內(nèi)NUCB2mRNA和蛋白表達(dá)均較正常組明顯下降，可能是通過代謝和內(nèi)分泌途徑促進(jìn)PCOS的發(fā)生發(fā)展；也有研究發(fā)現(xiàn)Nesfatin-1與卵泡刺激素、雌二醇、孕酮呈正相關(guān)，與黃體生成素、總睪酮呈負(fù)相關(guān)；PCOS患者血Nesfatin-1水平明顯降低，但高于卵泡液水平[13]。進(jìn)一步推測Nesfatin-1可能對多囊卵巢綜合征伴發(fā)的高雄激素血癥和肥胖癥有抑制作用，主要通過影響糖脂代謝及胰島素水平參與PCOS的發(fā)生發(fā)展。另外顆粒細(xì)胞內(nèi)P450芳香化酶、膽固醇側(cè)鏈裂解酶與Nesfatin-1可能存在一定的相關(guān)性，如果從此角度出發(fā)可能為PCOS患者的診療提供新思路。未來仍需大樣本研究監(jiān)測PCOS患者體內(nèi)Nesfatin-1水平，進(jìn)一步探索Nesfatin-1在PCOS患者的病理機(jī)制及發(fā)展演變。

3.4 Nesfatin-1參與細(xì)胞增殖凋亡

Nesfatin-1在調(diào)控顆粒細(xì)胞增殖凋亡方面與女性生殖息息相關(guān)。首先，細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是一種高度嚴(yán)密的程序化死亡，可能和神經(jīng)退行性病變、腫瘤、免疫性疾病等多種因素有關(guān)。Nazarnezhad等[14]研究曾指出Nesfatin-1可降低PC12細(xì)胞內(nèi)葡萄糖誘導(dǎo)的活性氧產(chǎn)生，進(jìn)而減少細(xì)胞神經(jīng)毒性，即抑制氧化應(yīng)激作用，并能減少PC12細(xì)胞的自噬和凋亡。此結(jié)果為治療糖尿病導(dǎo)致的神經(jīng)性病變提供了新思路。Jiang等[15]人在骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型體內(nèi)注射外源性Nesfatin-1，發(fā)現(xiàn)凋亡標(biāo)志物Caspase-3及其下游效應(yīng)蛋白等表達(dá)水平明顯降低，論證了Nesfatin-1可抑制白介素-1β導(dǎo)致的軟骨細(xì)胞的凋亡，改善大鼠的骨關(guān)節(jié)炎癥狀。Tasatargil等[16]研究指出Nesfatin-1在心肌梗死大鼠中可通過GSK-3β/Akt信號通路減少凋亡和壞死的細(xì)胞數(shù)量，起到保護(hù)心肌作用。Arabaci等[17]對大鼠睪丸行扭轉(zhuǎn)損傷后，給予Nesfatin-1干預(yù)，發(fā)現(xiàn)Caspase-3、白細(xì)胞介素-6等炎癥因子較損傷前水平顯著降低；并且增加了轉(zhuǎn)化生長因子的表達(dá)，降低了蛋白激酶B和cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白的表達(dá)，證明了Nesfatin-1是通過調(diào)控AKT和CREB信號通路調(diào)控促炎/抗炎穩(wěn)態(tài)，減少生精細(xì)胞凋亡。Ciccimarra等[18]研究指出，前體蛋白NUCB2基因在卵泡顆粒細(xì)胞中的表達(dá)高于中、小卵泡顆粒細(xì)胞，且Nesfatin-1通過修飾大卵泡顆粒細(xì)胞的NO生成等機(jī)制來刺激細(xì)胞增殖和黃體酮的產(chǎn)生，干擾氧化還原反應(yīng)。

此外，Nesfatin-1對血管生成素具有刺激作用。Cao等[6]研究指出Nesfatin-1在豬顆粒細(xì)胞和細(xì)胞膜細(xì)胞中均有表達(dá)，顆粒細(xì)胞內(nèi)的Nesfatin-1轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在小卵泡向大卵泡發(fā)育轉(zhuǎn)變的過程中逐漸減少，隨著豬卵泡發(fā)育，Nesfatin-1在顆粒細(xì)胞內(nèi)表達(dá)減少，Nesfatin-1對哺乳動物卵母細(xì)胞的成熟和發(fā)育都有刺激作用?？傊?，Nesfatin-1對各種細(xì)胞的增殖凋亡作用不盡一致，Nesfatin-1對于每一種細(xì)胞的具體調(diào)控需要大樣本研究證實。對生殖細(xì)胞的研究，特別是對人卵巢顆粒細(xì)胞的研究依然較少，且增殖與凋亡意見不一，未來的研究更應(yīng)該與其生殖功能相結(jié)合，深入探討它與生殖真實存在的相關(guān)性。

隨著人民生活水平的提高，生活節(jié)奏的加快，育齡期婦女的生殖功能有所下降，而且部分病變是不可逆的、永久性的，致使很多人喪失了做母親的信心?？v使體外受精-胚胎移植試管嬰兒技術(shù)飛速發(fā)展，也無法解決患者卵巢生殖功能之根本。站在新的視角，深入研究Nesfatin-1調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞增殖凋亡機(jī)制，對卵泡發(fā)育、卵母細(xì)胞質(zhì)量、胚胎的影響，證實它與不孕癥病因?qū)W之間的聯(lián)系，可能會發(fā)現(xiàn)用于治療不孕癥的潛在新療法，提高妊娠率，為不孕癥患者帶來新的孕育福音。