含齊墩果酸和熊果酸全草類(lèi)中藥的HPLC研究

查孝柱 ，毛小明 ，徐 源 ，曹 富 ，查光圣 ，姜 莉

（1.安慶醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校藥學(xué)系，安徽安慶246052；2.安徽光盛農(nóng)業(yè)股份有限公司，安徽安慶246632；3.安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥學(xué)部，安徽合肥230001）

齊墩果酸（Oleanolic Acid，OA）和熊果酸（Ursolic Acid，UA）均為五環(huán)三萜類(lèi)化合物，是多種中藥含有的活性成分，具有保肝、消炎、抗腫瘤、降血脂、增強(qiáng)免疫和抑制免疫等作用［1-2］。目前這2種物質(zhì)還只能從植物中提取，無(wú)法化學(xué)合成，其檢測(cè)方法有分光光度法［3］、薄層掃描法［4］和高效液相色譜法［5-8］。

本課題組將前期含齊墩果酸、熊果酸10種果實(shí)類(lèi)的HPLC-PDA分析建立了方法，但是含齊墩果酸、熊果酸全草類(lèi)中藥能否用所建立的方法進(jìn)行分析、常見(jiàn)的全草類(lèi)中藥含齊墩果酸、熊果酸的含量及分布情況、全草類(lèi)中藥能否作為提取齊墩果酸或者熊果酸的原料藥等問(wèn)題還鮮見(jiàn)報(bào)道。

本研究以馬鞭草、澤蘭、連錢(qián)草以及白花蛇舌草為研究對(duì)象，對(duì)常用含有齊墩果酸和熊果酸4種全草類(lèi)中藥材進(jìn)行了HPLC-PDA研究，并對(duì)含量測(cè)定結(jié)果進(jìn)行鑒定比較與分析，為齊墩果酸和熊果酸的提取以及相關(guān)中藥的質(zhì)量控制鑒別提供一定的依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

儀器分別為：Agilent1100高效液相色譜儀（包括G1311A泵、G1322脫氣機(jī)、G1313AZ自動(dòng)進(jìn)樣器、G1313A柱溫箱、G1315 DAD及ChemStation色譜工作站）、BP221D電子天平（德國(guó)Sartorius公司）以及超聲波清洗器等。

1.2 材料

實(shí)驗(yàn)所用藥材樣品來(lái)自安慶醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校藥學(xué)系，經(jīng)安慶醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校姚繩林副教授鑒定，齊墩果酸（批號(hào)：110709-200304）和熊果酸（批號(hào)：110742-200516）對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，水為超純水，甲醇為色譜純，其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜柱

1）Shim-pack CLC-ODS （M）柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；2） 流動(dòng)相為甲醇-水-冰乙酸-三乙胺（265∶35∶0.1∶0.05）；3）檢測(cè)波長(zhǎng)為 210 nm；4）柱溫 20 ℃；5）進(jìn)樣量 20 μL；6）理論塔板數(shù)按齊墩果酸峰計(jì)應(yīng)不低于7 000；7）齊墩果酸與熊果酸色譜峰及其相鄰峰分離度大于1.68。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取齊墩果酸對(duì)照品和熊果酸對(duì)照品適量，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL含齊墩果酸0.108 mg和熊果酸0.103 mg的混合對(duì)照品溶液，搖勻。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱(chēng)取樣品（馬鞭草、澤蘭、連錢(qián)草以及白花蛇舌草）細(xì)粉各約0.5 g，精密稱(chēng)定，分別置具塞錐形瓶中，用25 mL移液管精密加入甲醇25 mL，密塞，稱(chēng)定重量，超聲提?。?50 W，40 kHz）30 min，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，混勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)。

2.4 含量測(cè)定

取臨床常用的含有齊墩果酸和熊果酸的4種全草類(lèi)藥材，按2.3項(xiàng)下制備供試品溶液，并按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，采用外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果如表1所示。齊墩果酸和熊果酸對(duì)照品液HPLC如圖1所示。圖1中a為齊墩果酸，b為熊果酸。

表1 4種全草類(lèi)中藥中齊墩果酸和熊果酸的百分含量（n=2）

圖1 齊墩果酸和熊果酸對(duì)照品溶液HPLC

3 討論

3.1 不同全草類(lèi)中藥中齊墩果酸和熊果酸含量比較

表1表明，4種全草類(lèi)中藥中都同時(shí)存在齊墩果酸和熊果酸，但含量高低存在明顯差異。

馬鞭草和澤蘭齊墩果酸、熊果酸總含量較高，齊墩果酸含量最高的是白花蛇舌草，熊果酸含量最高的是馬鞭草。因此，以提取齊墩果酸為目的，可以選擇白花蛇舌草；以提取熊果酸為目的，可以選擇馬鞭草；以提取總?cè)扑釣槟康模梢赃x擇馬鞭草和澤蘭。

本實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)還有待進(jìn)一步考察不同品種、產(chǎn)地、采收時(shí)間及炮制方法等因素的影響，研究的中藥材有待加大樣品批次進(jìn)一步研究。

3.2 不同全草類(lèi)中藥HPLC色譜圖比較

澤蘭、馬鞭草、連錢(qián)草及白蘭蛇舌草4種全草類(lèi)中藥材HPLC如圖2所示。

圖2顯示，在所用的提取、分離和檢測(cè)條件下，4種所測(cè)的全草類(lèi)中藥材除了有齊墩果酸和熊果酸峰之外，各色譜圖中峰數(shù)、峰位和峰強(qiáng)度表現(xiàn)出一定的可區(qū)分性，可用該方法鑒別這4種全草類(lèi)藥材，各樣品的鑒別特征有待增加同種樣品批數(shù)作進(jìn)一步研究。

圖2 4種全草類(lèi)中藥材HPLC

3.3 色譜條件的選擇

在對(duì)全草類(lèi)中藥材齊墩果酸與熊果酸的分離檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，分別對(duì)流動(dòng)相（甲醇-水、甲醇-乙腈-水、乙腈-水），緩沖對(duì)（氫氟酸、磷酸、冰乙酸、三乙胺），檢測(cè)波長(zhǎng)（200、205、210、215、220 nm），流速（0.4、0.6、1 mL/min）進(jìn)行考察，最終確定最佳的色譜條件為：流動(dòng)相甲醇-水、緩沖對(duì)冰乙酸、三乙胺、檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm、流速0.6 mL/min。

實(shí)驗(yàn)表明，在所確定最佳的色譜條件下，齊墩果酸與熊果酸之間分離度均較好（R＞1.68）；理論塔板數(shù)按齊墩果酸峰計(jì)應(yīng)不低于7 000，也達(dá)到規(guī)定要求；齊墩果酸和熊果酸的保留時(shí)間分別為27.9和29.3 min。

3.4 提取條件的選擇

在對(duì)全草類(lèi)中藥材齊墩果酸、熊果酸提取的過(guò)程中，分別考察了不同溶劑（甲醇、無(wú)水乙醇、乙酸乙酯、三氯甲烷、乙醚）、不同體積比（10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1）、不同提取方式（回流、索氏提取、超聲、冷浸）、不同提取時(shí)間（10、20、30、40、50 min），最終確定全草類(lèi)中藥齊墩果酸、熊果酸的最佳提取工藝為：取約0.5 g馬鞭草、澤蘭、連錢(qián)草以及白花蛇舌草粉末，用25 mL甲醇提取30 min。

4 小結(jié)

本研究采用反相高效液相色譜法建立了全草類(lèi)中藥材齊墩果酸與熊果酸含量的測(cè)定鑒定方法，該方法操作簡(jiǎn)便、快速，結(jié)果準(zhǔn)確，可作為全草類(lèi)中藥齊墩果酸、熊果酸含量的測(cè)定鑒定方法。從測(cè)定結(jié)果來(lái)看，建議如果以提取齊墩果酸為目的時(shí)就選擇白花蛇舌草，如果以提取熊果酸為目的時(shí)就選擇馬鞭草，如果以提取總?cè)扑釣槟康臅r(shí)就選擇馬鞭草和澤蘭。