VITEK MS細(xì)菌質(zhì)譜儀臨床應(yīng)用及效益分析

馬憲禮 梁建 仲輝 李真 周林 成定勝

(江蘇省蘇北人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)工程部，江蘇 揚(yáng)州 225001)

基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-TOF MS)是目前微生物鑒定領(lǐng)域革命性的新技術(shù)，與常規(guī)鑒定方法相比，其具有快速準(zhǔn)確、檢測(cè)樣本用量少、檢測(cè)成本低等優(yōu)點(diǎn)。MALDI-TOF質(zhì)譜儀不僅可準(zhǔn)確鑒定臨床細(xì)菌和酵母菌屬，還可用于分枝桿菌屬、絲狀真菌的鑒定以及微生物分類(lèi)學(xué)和流行病學(xué)的研究[1-2]。2013年，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(U.S.Food and Drug Administration,U.S FDA)首次承認(rèn)MALDI-TOF可用于對(duì)微生物的臨床鑒定。我院臨床醫(yī)學(xué)檢測(cè)中心于2016年購(gòu)入一臺(tái)法國(guó)梅里埃公司生產(chǎn)的全自動(dòng)快速微生物質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)VITEK MS，該儀器采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-TOF MS)，已使用4年左右，在臨床使用過(guò)程中對(duì)該儀器逐漸熟悉了解，本文主要介紹該儀器的檢測(cè)原理，臨床使用操作過(guò)程，相比較傳統(tǒng)細(xì)菌鑒定方法的快速性及準(zhǔn)確性，使用該儀器所能節(jié)約的成本和創(chuàng)造的經(jīng)濟(jì)效益，以及目前質(zhì)譜儀的臨床應(yīng)用現(xiàn)狀等。

1 VITEK MS質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)的基本原理

激光照射生物分子與基質(zhì)結(jié)合形成的共結(jié)晶時(shí)，基質(zhì)吸收能量并將其轉(zhuǎn)移到生物分子使之電離成碎片離子，離子經(jīng)電場(chǎng)加速，由于質(zhì)荷比(m/z)以及信號(hào)相對(duì)強(qiáng)度的不同，在磁場(chǎng)中飛行時(shí)間不同而被檢測(cè)，形成特有的指紋圖譜，其與數(shù)據(jù)庫(kù)中的標(biāo)準(zhǔn)圖譜經(jīng)對(duì)比即可鑒定細(xì)菌。有學(xué)者報(bào)道，相比DNA測(cè)序鑒定，VITEK MS快速鑒定96%的苛養(yǎng)革蘭陰性菌到種水平，其也可準(zhǔn)確鑒定85%的需氧革蘭陽(yáng)性菌[3]。因而，質(zhì)譜方法比傳統(tǒng)生化表型鑒定、分子生物學(xué)鑒定更快速準(zhǔn)確。儀器主要由3個(gè)部分構(gòu)成：①樣本電離室，在該區(qū)域激光將樣本進(jìn)行汽化；②飛行時(shí)間質(zhì)量分析器；③粒子探測(cè)器。VITEK MS原理分析見(jiàn)圖1。

圖1 VITEK MS原理分析

2 VITEK MS 質(zhì)譜儀臨床應(yīng)用

可用于分析多種類(lèi)型的樣本，包含核酸、蛋白質(zhì)、微生物，后兩者對(duì)于臨床微生物領(lǐng)域非常有用。樣本鑒定之前，先準(zhǔn)備樣本，將所要鑒定的樣本涂布在靶板上，然后在樣本點(diǎn)位加上基質(zhì)。基質(zhì)要具有以下幾點(diǎn)特性：易于升華、在儀器激光的波長(zhǎng)范圍內(nèi)具有強(qiáng)吸光度。其中α-氰基-4-羥基肉桂酸(α-Cyano-4-hydroxy-cinnamic acid)是在微生物鑒定中常用的基質(zhì)。靶板上涂布上樣本和基質(zhì)后，靶板加載入樣本電離室，在激光的作用下進(jìn)行電離。MALDI-TOF MS儀器一般選用紫外氮激光器(337nm)。激光輻射導(dǎo)致基質(zhì)的震動(dòng)和激發(fā)，分析物分子排出（解析）。一旦分析物分子被解析出來(lái)，基質(zhì)分子就傳送質(zhì)子給分析物，導(dǎo)致產(chǎn)生氣相的帶正電荷的分析物陽(yáng)離子。這些氣相分析物陽(yáng)離子在樣本電離室中經(jīng)過(guò)電場(chǎng)的加速，獲得一個(gè)初速度，其初速度的大小與其質(zhì)荷比(m/z)相關(guān)，然后離子離開(kāi)電離室進(jìn)入飛行時(shí)間質(zhì)量分析器進(jìn)行分離，通過(guò)分析器末端的微粒探測(cè)器來(lái)測(cè)量其飛行時(shí)間，從而推算出微粒的質(zhì)荷比(m/z)，樣本的質(zhì)譜圖也由此生成[4-5]。

每一種微生物都有一張?zhí)禺愋缘馁|(zhì)譜圖，其中包含豐富的可溶性蛋白，如核糖體蛋白、熱擊蛋白等。將未知的微生物質(zhì)譜圖與由已知微生物種圖譜建立起來(lái)的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，最佳的匹配則推薦為該未知微生物的鑒定結(jié)果。這一技術(shù)的成功應(yīng)用，其關(guān)鍵因素是微生物體全蛋白質(zhì)譜圖足夠的豐富與獨(dú)特，可以使鑒定結(jié)果確定到屬、種水平，個(gè)別種類(lèi)可以鑒定到菌株水平，即使只應(yīng)用了蛋白質(zhì)組中只有一小部分[7]。

VITEK MS質(zhì)譜儀臨床應(yīng)用具體操作步驟見(jiàn)圖2～5。

3 質(zhì)譜儀效益分析

3.1 直接經(jīng)濟(jì)效益

使用質(zhì)譜儀以后醫(yī)院可以停止使用目前用于VITKE 2上的鑒定板；醫(yī)院目前每天100個(gè)標(biāo)本，陽(yáng)性率為30%，則每天鑒定的標(biāo)本在30個(gè)左右，目前所用鑒定板的價(jià)格是每個(gè)標(biāo)本48元，使用質(zhì)譜鑒定成本在2元左右，所以就直觀而言，每年鑒定細(xì)菌直接節(jié)省成本為496 800元[8]。

3.2 綜合效益

圖2 涂靶板

圖3 加1ul CHCA基質(zhì)

圖4 MS檢測(cè)

圖5 查看結(jié)果

使用質(zhì)譜鑒定以后能夠減少TAT時(shí)間，減少患者住院時(shí)間，對(duì)于病床的周轉(zhuǎn)率有很大的提高，因此可以提高醫(yī)院的綜合收入。此外，使用質(zhì)譜儀以后，由于目前使用的鑒定藥敏儀和質(zhì)譜儀的無(wú)縫連接，可以縮短報(bào)告時(shí)間，大部分的常見(jiàn)細(xì)菌能在6～8h出藥敏結(jié)果，所以對(duì)臨床的指導(dǎo)幫助提高，臨床因此會(huì)有更多的標(biāo)本送檢，因此可以提高醫(yī)院的綜合收入。

3.3 社會(huì)效益

因?yàn)橘|(zhì)譜儀本身存在的快速鑒定、鑒定結(jié)果準(zhǔn)確等特點(diǎn)，因此可以提高醫(yī)院病患的治愈率和診療水平，還可以減少病人的死亡率，提高醫(yī)院的社會(huì)地位[9]。

4 質(zhì)譜儀在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用現(xiàn)狀

4.1 質(zhì)譜儀在微生物鑒定中的應(yīng)用

近幾年，隨著科技的發(fā)展質(zhì)譜技術(shù)已成為微生物鑒定分類(lèi)的主流技術(shù)，質(zhì)譜儀具有操作簡(jiǎn)便、快速準(zhǔn)確、低成本、微生物數(shù)據(jù)庫(kù)及分析軟件可以不斷更新升級(jí)等優(yōu)點(diǎn)，質(zhì)譜技術(shù)是通過(guò)對(duì)微生物表面蛋白分子的檢測(cè)，得出該微生物獨(dú)特的蛋白質(zhì)指紋圖譜及圖譜峰值，與數(shù)據(jù)庫(kù)中已知微生物指紋圖譜進(jìn)行對(duì)比，從而得出被檢微生物的品種，由于質(zhì)譜技術(shù)是對(duì)微生物表面特異蛋白進(jìn)行檢測(cè)，其準(zhǔn)確性極高，能夠區(qū)別相似或相近的微生物，隨著數(shù)據(jù)庫(kù)的不斷更新升級(jí)，質(zhì)譜儀不但可以鑒別已知微生物，還可以發(fā)現(xiàn)新種類(lèi)的微生物。目前質(zhì)譜儀已可以快速準(zhǔn)確鑒定酵母菌屬、分枝桿菌屬、厭氧菌、絲狀真菌、革蘭陽(yáng)性菌、革蘭陰性菌等[10]。

4.2 質(zhì)譜儀在生化檢測(cè)中的應(yīng)用

在生化檢測(cè)方面，相對(duì)于傳統(tǒng)檢測(cè)方法，質(zhì)譜技術(shù)具有明顯的優(yōu)勢(shì)，一些質(zhì)譜技術(shù)使用較早的國(guó)家，已將化學(xué)發(fā)光方法、免疫學(xué)方法和質(zhì)譜技術(shù)共同列為最主要的三大生化檢測(cè)方法，越來(lái)越多的生化項(xiàng)目正逐漸使用質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，目前在生化檢測(cè)方面已開(kāi)展較為成熟的項(xiàng)目有：類(lèi)固醇激素檢測(cè)、營(yíng)養(yǎng)成分檢測(cè)、毒素檢測(cè)、臨床用藥效果監(jiān)測(cè)等，內(nèi)分泌科中許多類(lèi)固醇激素分泌濃度較低，相比于傳統(tǒng)免疫法檢測(cè)，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LCMS/MS)具有標(biāo)本需求量低，高特異性等優(yōu)點(diǎn)，近幾年國(guó)外許多臨床檢測(cè)中心已將質(zhì)譜技術(shù)列為類(lèi)固醇檢測(cè)的首要方法，隨著質(zhì)譜技術(shù)的不斷發(fā)展完善，質(zhì)譜技術(shù)也將成為生化檢測(cè)領(lǐng)域的發(fā)展方向[11-12]。

5 小結(jié)

綜上所述，VITEK MS質(zhì)譜儀經(jīng)過(guò)多年快速的發(fā)展技術(shù)已經(jīng)相當(dāng)成熟，相比于傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)優(yōu)勢(shì)明顯，樣本需求量少，操作簡(jiǎn)單明了，高特異性質(zhì)譜圖所得鑒定結(jié)果快速準(zhǔn)確，低成本能為醫(yī)院帶來(lái)更好的經(jīng)濟(jì)效益。隨著質(zhì)譜技術(shù)的不斷發(fā)展，質(zhì)譜技術(shù)今后會(huì)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域和高新技術(shù)科研中得到更廣泛的應(yīng)用[13]。