黃秀容,張子強,賴名殷,余瑾,袁青

(1.深圳市人民醫(yī)院,深圳 518001;2.廣州中醫(yī)藥大學針灸康復臨床醫(yī)學院,廣州 510405)

卒中在臨床中又被稱為中風,是神經(jīng)系統(tǒng)主要疾病之一,其中 80%以上為缺血性卒中,該病致死率及致殘率高,治療周期長,預后差,多數(shù)患者會留下活動及語言功能喪失、偏癱等后遺癥,使患者生活信心喪失,造成極大的身心損傷,并給其家庭和社會帶來沉重的經(jīng)濟負擔[1-2]。針灸治療卒中具有良好的療效,一直是臨床研究的重點,其與高壓氧、康復訓練聯(lián)合綜合治療,可協(xié)同改善卒中患者吞咽障礙[3];與PNF康復技術(shù)聯(lián)合治療卒中偏癱患者,可有效促進其上肢運動功能恢復,提高患者的生活質(zhì)量[4],但其具體作用機制目前還未闡釋清楚。小膠質(zhì)細胞激活誘導的神經(jīng)炎癥是局灶性缺血性卒中的主要致病基礎[5],miR-128-3p可調(diào)控炎癥反應,下調(diào) miR-128-3p表達,可通過抑制核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)通路活性而顯著減弱炎癥反應[6],且 miR-128b在腦梗死患者血清中高表達,與患者腦梗死嚴重程度呈正相關(guān),是腦梗死的危險因素[7]。另外,紅系衍生的核轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子(nuclear factor erythroid-derived 2-like 2,Nrf2)是炎癥及氧化應激的負調(diào)控因子,上調(diào) Nrf2表達,可抑制小膠質(zhì)細胞激活,減輕腦損傷[8]。然而針刺是否通過調(diào)控miR-128-3p改善卒中大鼠的神經(jīng)功能及對Nrf2表達的影響目前還未見研究,本文通過建立腦缺血再灌注大鼠模型,對此進行探討。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SD大鼠(康美華大基因技術(shù)有限公司),清潔級,動物生產(chǎn)許可證號 SCXK(粵)2019-0027,動物使用許可證號 SYXK(粵)2019-0137,動物質(zhì)量合格證號0019012317,雄性,體質(zhì)量(200±20)g,所有大鼠在本院動物房中飼養(yǎng),適應 1周后進行實驗。飼養(yǎng)條件為12 h/12 h交替照明,大鼠自由飲食、飲水,動物房環(huán)境應清潔、安靜、通風良好,溫度為(25±1)℃,相對濕度為(50±5)%。

1.2 主要試劑及儀器

華佗牌針灸針(0.25 mm×15 mm,190617,蘇州醫(yī)療用品有限公司);miR-128-3p agomir、miR-128-3p agomir陰性對照(C0719、C0811,上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司);大鼠S100β ELISA試劑盒(YS04063B,上海雅吉生物科技有限公司);NSE ELISA試劑盒(SBJ-R0081,南京森貝伽生物科技有限公司);大鼠IL-6 ELISA試劑盒、TNF-α ELISA試劑盒、GAPDH一抗、兔源Nrf2一抗、羊抗兔二抗(ab100772、ab100785、ab181602、ab137550、ab150077,Abcam公司);RNAiso Plus、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(9108、RR037Q/A/B、639519,Takara公司);蛋白提取試劑盒(C006325-0150,上海生工生物工程股份有限公司);BCA試劑盒、蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色試劑盒(P0011、C0105,上海碧云天生物技術(shù)有限公司);光學顯微鏡(SMZ745,尼康公司);切片機(CM3050S,Leica公司,德國);酶標儀(XElx800,Perkin Elmer公司);高通量DNA合成儀(3900,應用生物系統(tǒng)公司);凝膠成像系統(tǒng)(2500,上海天能公司)。

1.3 模型制備及分組

參考文獻中方法[9]制備 MACO模型,具體為腹腔注射45 mg/kg劑量的2.5%戊巴比妥鈉溶液麻醉大鼠,仰臥固定在操作臺后,消毒、頸部備皮、鋪巾,逐層打開頸部,鈍性分離大鼠左側(cè)頸總動脈(common carotid artery,CCA)、頸外動脈(external CA,ECA)、頸內(nèi)動脈(internal CA,ICA),并以縫合線結(jié)扎 CCA、ECA近心端,同時以動脈夾夾閉ICA,于CCA分叉部4 mm處剪一小口,將一根直徑為 0.24 mm栓線插入 CCA直到ICA,使大腦中動脈血流受阻,將拴線尾端部分固定于皮膚外后逐層縫合切口,2 h后抽出栓線即完成模型制備。觀察大鼠活動情況,根據(jù)Longa分級法[10]對其神經(jīng)功能缺損進行評分,標準如下,無神經(jīng)功能缺損,0分;不能完全伸展對側(cè)前爪,1分;行走向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈,2分;行走向?qū)?cè)傾倒,3分;意識喪失,不能自發(fā)行走,4分;死亡,5分。當評分達到1～3分時表示模型制備成功[10],共制備65只,成功60只,隨機分為模型組、激動劑組、激動劑陰性對照組、針刺組、針刺＋激動劑組,每組12只。另取12只大鼠僅分離CCA、ECA、ICA后縫合傷口,其他操作相同,設為假手術(shù)組。

參照文獻[11]針刺組、針刺＋激動劑組大鼠于雙側(cè)陽陵泉穴及曲池穴行針(參照《實驗針灸學》“動物針灸穴位圖譜”及解剖學方法進行大鼠穴位定位),每10 min行針1次,捻轉(zhuǎn)角度180°,頻率每分鐘80次,力度均勻適中,每次行針持續(xù) 1 min,共留針 30 min,每日1次,持續(xù)治療7 d。參照說明書及文獻[12],以生理鹽水溶解miR-128-3p agomir、miR-128-3p agomir陰性對照配制為終濃度 20 μM的溶液,以 5 mL/kg劑量對激動劑組、激動劑陰性對照組、針刺＋激動劑組大鼠進行尾靜脈注射,假手術(shù)組、模型組和針刺組尾靜脈注射等劑量生理鹽水,每日1次,持續(xù)7 d。

1.4 指標檢測

1.4.1 大鼠神經(jīng)功能損傷檢測及標本收集

末次給藥24 h后,對各組大鼠進行神經(jīng)功能缺損評分,然后尾靜脈取血 4 mL,靜置后離心,取上清液即為血清,儲存在﹣80℃?zhèn)溆谩⒋笫舐樽砗筇幩?解剖后獲得腦皮質(zhì)組織,部分分裝為0.5 g/管,置于液氮中速凍10 min后,移至﹣80℃保存?zhèn)溆?部分腦皮質(zhì)組織以生理鹽水漂洗干凈,置于 4%多聚甲醛溶液中固定,使用低濃度到高濃度梯度乙醇依次處理脫水,經(jīng)二甲苯透明、石蠟包埋后,采用切片機做病理切片備用。

1.4.2 大鼠腦皮質(zhì)組織病理損傷檢測

選取完整的腦皮質(zhì)切片,經(jīng)脫蠟、高濃度到低濃度梯度乙醇浸泡處理后,參照HE試劑盒說明書的步驟進行HE染色,再次脫水、透明后封片,使用光學顯微鏡觀察大鼠腦皮質(zhì)組織病理變化,任選5個視野進行拍照。

1.4.3 大鼠血清S100β、NSE、IL-6、TNF-α水平檢測

血清置于4℃冰箱中解凍,以大鼠ELISA試劑盒檢測其中 S100β、NSE、IL-6、TNF-α水平,具體操作如下。將梯度稀釋的標準品及樣品分別加入酶標板孔內(nèi),每孔 100 μL,封孔后置于 37℃孵育 90 min,洗板 3次;然后分別添加生物素抗體溶液,每孔 100 μL,置于37℃孵育45 min,洗板3次;再分別添加酶反應底物溶液,每孔100 μL,37℃避光孵育15 min;加入反應終止液 50 μL,采用酶標儀檢測各孔在 450 nm下吸光值(optical density,OD),繪制標準品濃度與OD值曲線圖,根據(jù)樣品OD值計算其濃度。

1.4.4 大鼠腦皮質(zhì)組織miR-128-3p、Nrf2 mRNA水平檢測

取腦皮質(zhì)組織 0.5 g粉碎后,加入 RNAiso Plus混勻后,參照其說明書的操作步驟提取總 RNA,然后以逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄后進行熒光定量PCR反應,反應體系如下。SYBR? Premix EX Taq TMⅡ(2×)10 μL,上下游引物各 1 μL,cDNA 1.5 μL,無菌水6.5 μL,總計20 μL。反應條件為95℃ 30 s,1個循環(huán);95℃ 5 s,60℃ 30 s,40個循環(huán)。miR-128-3p、U6、Nrf2、GAPDH引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。以U6為miR-128-3p的內(nèi)參,以GAPDH為Nrf2的內(nèi)參,采用 2﹣ΔΔ3)t算法對所得實驗數(shù)據(jù)進行計算分析,進而得到各組大鼠 miR-128-3p、Nrf2 mRNA相對表達量,各基因引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

1.4.5 大鼠腦皮質(zhì)組織Nrf2蛋白表達檢測

取0.5 g腦皮質(zhì)組織粉碎后,加入蛋白裂解液混勻制備為勻漿液,離心后取上清液,獲得總蛋白樣品液,采用BCA試劑盒測量蛋白總濃度,煮沸變性后,各組取含相同質(zhì)量總蛋白的樣品液上樣,進行電泳使蛋白分離,然后將其轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,置于5%脫脂奶粉溶液中室溫封閉,根據(jù)目的蛋白分子量截取蛋白條帶置于孵育盒中,分別加入兔源一抗 GAPDH(1:1000)、Nrf2(1:500),于 4℃冰箱中孵育過夜,經(jīng) TBST漂洗 3次,加入羊抗兔二抗(1:2000),于搖床上室溫孵育2 h,經(jīng)TBST再次漂洗3次,采用增強化學發(fā)光法顯色,使用凝膠成像系統(tǒng)對蛋白條帶進行拍照,并以 Quantity One軟件分析圖像,得到各組蛋白相對表達量。

1.5 統(tǒng)計學方法

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS24.0軟件進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標準差表示。符合正態(tài)分布和方差齊性的計量資料,組間比較采用單因素方差分析,進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗;若不符合則采用Kruskal-Wallis檢驗。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能比較

與假手術(shù)組相比,模型組大鼠神經(jīng)功能缺損評分明顯升高(P＜0.05)。與模型組相比,激動劑組大鼠神經(jīng)功能缺損評分升高(P＜0.05),激動劑陰性對照組大鼠無明顯變化(P＞0.05),針刺組大鼠神經(jīng)功能缺損評分降低(P＜0.05)。與針刺組比較,針刺＋激動劑組大鼠神經(jīng)功能缺損評分升高(P＜0.05)。與激動劑組比較,針刺＋激動劑組大鼠神經(jīng)功能缺損評分降低(P＜0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較 (±s,分)

表2 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較 (±s,分)

注:與假手術(shù)組比較 1)P＜0.05;與模型組比較 2)P＜0.05;與針刺組比較3)P＜0.05;與激動劑組比較4)P＜0.05

組別 n 神經(jīng)功能缺損評分假手術(shù)組 12 0模型組 12 2.46±0.431)激動劑組 12 3.62±0.352)激動劑陰性對照組 12 2.48±0.411)針刺組 12 0.18±0.052)針刺＋激動劑組 12 2.53±0.521)3)4)

2.2 各組大鼠腦皮質(zhì)組織病理學形態(tài)

假手術(shù)組大鼠腦皮質(zhì)中神經(jīng)元無病理損傷。模型組大鼠腦皮質(zhì)中神經(jīng)元呈現(xiàn)細胞核收縮變小、細胞壞死、數(shù)量減少等病理損傷。與模型組相比,針刺組大鼠腦皮質(zhì)中神經(jīng)元病理損傷減輕,激動劑組大鼠腦皮質(zhì)中神經(jīng)元病理損傷加重,激動劑陰性對照組大鼠無明顯變化。與針刺組比較,針刺＋激動劑組大鼠腦皮質(zhì)中神經(jīng)元細胞核皺縮、細胞壞死等病理損傷加重。與激動劑組比較,針刺＋激動劑組大鼠腦皮質(zhì)中神經(jīng)元上述病理損傷減輕。詳見圖1。

圖1 各組大鼠腦皮質(zhì)組織HE染色結(jié)果(×200)

2.3 各組大鼠血清 S100β、NSE、IL-6、TNF-α水平比較

與假手術(shù)組相比,模型組大鼠血清 S100β、NSE、IL-6、TNF-α水平明顯升高(P＜0.05)。與模型組相比,針刺組大鼠血清 S100β、NSE、IL-6、TNF-α水平降低(P＜0.05),激動劑組大鼠血清 S100β、NSE、IL-6、TNF-α水平升高(P＜0.05),激動劑陰性對照組大鼠無明顯變化(P＞0.05)。與針刺組比較,針刺＋激動劑組大鼠血清 S100β、NSE、IL-6、TNF-α水平升高(P＜0.05)。與激動劑組比較,針刺＋激動劑組大鼠血清S100β、NSE、IL-6、TNF-α水平降低(P＜0.05)。詳見表3。

表3 各組大鼠血清中S100β、NSE、IL-6、TNF-α水平比較 (±s)

表3 各組大鼠血清中S100β、NSE、IL-6、TNF-α水平比較 (±s)

注:與假手術(shù)組比較1)P＜0.05;與模型組比較2)P＜0.05;與針刺組比較3)P＜0.05;與激動劑組比較4)P＜0.05

組別 n S100β(ng/mL) NSE(ng/mL) IL-6(pg/mL) TNF-α(pg/mL)假手術(shù)組 12 6.15±1.03 72.83±12.07 33.02±2.26 36.03±2.43模型組 12 76.37±9.981) 151.87±25.611) 76.95±5.321) 81.63±5.271)激動劑組 12 119.67±20.572) 203.12±40.532) 110.07±20.342) 127.43±24.182)激動劑陰性對照組 12 76.84±10.121) 152.43±26.011) 77.24±6.211) 83.21±18.341)針刺組 12 6.89±1.092) 75.19±12.562) 34.39±2.352) 37.12±2.642)針刺＋激動劑組 12 79.23±10.451)3)4) 155.37±27.231)3)4) 78.12±6.541)3)4) 82.73±6.321)3)4)

2.4 各組大鼠腦皮質(zhì)組織 miR-128-3p、Nrf2 mRNA水平比較

與假手術(shù)組相比,模型組大鼠腦皮質(zhì)組織 miR-128-3p水平明顯升高(P＜0.05),Nrf2 mRNA水平明顯降低(P＜0.05)。與模型組相比,針刺組大鼠腦皮質(zhì)組織miR-128-3p水平降低(P＜0.05),Nrf2 mRNA水平升高(P＜0.05);激動劑組大鼠腦皮質(zhì)組織 miR-128-3p水平升高(P＜0.05),Nrf2 mRNA水平降低(P＜0.05);激動劑陰性對照組大鼠無明顯變化(P＞0.05)。與針刺組比較,針刺＋激動劑組大鼠腦皮質(zhì)組織 miR-128-3p水平升高(P＜0.05),Nrf2 mRNA水平降低(P＜0.05)。與激動劑組比較,針刺＋激動劑組大鼠腦皮質(zhì)組織miR-128-3p水平降低(P＜0.05),Nrf2 mRNA水平升高(P＜0.05)。詳見表4。

2.5 各組大鼠腦皮質(zhì)組織中Nrf2蛋白表達

與假手術(shù)組相比,模型組大鼠腦皮質(zhì)組織中 Nrf2蛋白表達明顯降低(P＜0.05)。與模型組相比,針刺組大鼠腦皮質(zhì)組織中 Nrf2蛋白表達升高(P＜0.05),激動劑組大鼠腦皮質(zhì)組織中 Nrf2蛋白表達降低(P＜0.05),激動劑陰性對照組大鼠無明顯變化(P＞0.05)。與針刺組比較,針刺＋激動劑組大鼠腦皮質(zhì)組織中Nrf2蛋白表達降低(P＜0.05)。與激動劑組比較,針刺＋激動劑組大鼠腦皮質(zhì)組織中 Nrf2蛋白表達升高(P＜0.05)。詳見圖2、表5。

表4 各組大鼠腦皮質(zhì)組織miR-128-3p、Nrf2 mRNA水平比較 (±s)

表4 各組大鼠腦皮質(zhì)組織miR-128-3p、Nrf2 mRNA水平比較 (±s)

注:與假手術(shù)組比較 1)P＜0.05;與模型組比較 2)P＜0.05;與針刺組比較3)P＜0.05;與激動劑組比較4)P＜0.05

組別 n miR-128-3p/U6 Nrf2/GAPDH假手術(shù)組 12 0.98±0.20 0.99±0.23模型組 12 2.15±0.431) 0.59±0.051)激動劑組 12 3.07±0.742) 0.23±0.542)激動劑陰性對照組 12 2.14±0.511) 0.57±0.071)針刺組 12 1.03±0.232) 0.95±0.162)針刺＋激動劑組 12 2.12±0.531)3)4) 0.56±0.081)3)4)

圖2 各組大鼠腦皮質(zhì)組織中Nrf2蛋白表達

表5 各組大鼠腦皮質(zhì)組織中Nrf2蛋白相對表達比較 (±s)

表5 各組大鼠腦皮質(zhì)組織中Nrf2蛋白相對表達比較 (±s)

注:與假手術(shù)組比較 1)P＜0.05;與模型組比較 2)P＜0.05;與針刺組比較3)P＜0.05;與激動劑組比較4)P＜0.05

組別 n Nrf2/GAPDH假手術(shù)組 12 0.73±0.13模型組 12 0.38±0.091)激動劑組 12 0.10±0.032)激動劑陰性對照組 12 0.36±0.081)針刺組 12 0.72±0.152)針刺＋激動劑組 12 0.37±0.071)3)4)

3 討論

近年隨著社會的發(fā)展,卒中發(fā)病率逐年升高,并趨于年輕化,然而患者治愈率低,且大多存在各種后遺癥,其中約 33.3%的患者會遺留永久殘疾,一直是臨床研究的熱點及難點[13-14]。研究發(fā)現(xiàn),興奮性毒性、炎癥反應、氧化應激是缺血性卒中的主要病理過程,缺血缺氧及血液再灌注可激活神經(jīng)膠質(zhì)細胞,大量合成促炎因子白介素(interleukin,IL)-6、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α釋放進入血液,引發(fā)機體炎癥反應,影響卒中發(fā)生發(fā)展[15-18]。另外,缺血再灌注可致血腦屏障受損,進一步導致星形膠質(zhì)細胞標志蛋白S100β及神經(jīng)組織中神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuronspecific enolase,NSE)進入血液,因而血清S100β、NSE水平可作為反映腦損傷的敏感指標[19]。本研究以大腦中動脈線栓法建立腦缺血再灌注大鼠模型,結(jié)果顯示,模型組大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元呈現(xiàn)細胞核收縮變小、細胞壞死等病理損傷,且神經(jīng)功能缺損評分顯著高于假手術(shù)組,表明模型建立成功。本研究還發(fā)現(xiàn),與假手術(shù)組比較,模型組大鼠血清中 S100β、NSE、IL-6及TNF-α水平明顯升高,提示模型組大鼠存在一定程度炎癥反應。

針刺是中醫(yī)常規(guī)治療方法,目前已成為臨床治療卒中的常用手段,針刺可降低急性缺血性卒中患者血清炎性因子水平,抑制其炎癥反應,改善卒中后上肢痙攣等臨床癥狀[20-21]。檢索文獻發(fā)現(xiàn),陽陵泉穴、曲池穴被用于卒中治療較多,《針灸大成》:“陽陵泉穴主膝股內(nèi)外廉不仁,偏風半身不遂?！薄夺t(yī)宗金鑒》:“曲池主治卒中,手攣急痛痹風?！爆F(xiàn)代醫(yī)學研究發(fā)現(xiàn),針刺卒中患者陽陵泉穴可顯著降低執(zhí)行控制網(wǎng)絡功能連接度,有利于患者腦功能及運動功能恢復[22]。針刺缺血再灌注大鼠曲池穴可抑制大腦皮質(zhì)中神經(jīng)細胞凋亡,改善神經(jīng)功能評分[23]。因此,本研究對缺血性卒中大鼠雙側(cè)陽陵泉穴、曲池穴進行針灸,結(jié)果顯示,與模型組比較,針刺組大鼠腦皮質(zhì)病理損傷減輕,神經(jīng)功能缺損評分及血清中S100β、NSE、IL-6及TNF-α水平顯著降低,表明針刺可減輕缺血性卒中大鼠腦組織損傷,降低大鼠炎癥反應,恢復神經(jīng)功能,然而其具體的分子機制不清楚。

miR-128-3p可參與調(diào)控機體炎癥、氧化應激等生理過程[24-27],風濕性關(guān)節(jié)炎患者血清 miR-128-3p及IL-6等炎癥因子水平顯著升高,下調(diào)miR-128表達可抑制T細胞釋放炎癥因子[6]。Shyamasundar S等[28]發(fā)現(xiàn),miR-128過度表達可增強腎臟細胞促炎因子表達,促使腎組織炎癥進展。Nrf2介導抗氧化信號通路,上調(diào)其表達可抑制氧化應激損傷,促使成人神經(jīng)干細胞成活及增殖,增強成人神經(jīng)干細胞替代療法對卒中患者腦組織的保護作用[29-31]。Zhou F等[32]研究發(fā)現(xiàn),五味子甲素可通過激活Nrf2通路降低IL-6、TNF-α等促炎因子表達,抑制氧化應激反應,從而保護缺血再灌注腦損傷。本研究發(fā)現(xiàn),與模型組比較,針刺組大鼠腦皮質(zhì)組織miR-128-3p水平降低,Nrf2 mRNA及蛋白水平升高,表明針刺可能通過下調(diào) miR-128-3p表達,上調(diào)Nrf2表達,抑制炎癥發(fā)生,從而減輕缺血再灌注所致腦損傷。為進一步探討miR-128-3p在針刺治療卒中的作用,本研究采用激動劑過表達 miR-128-3p,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與針刺組比較,針刺＋激動劑組大鼠腦皮質(zhì)組織miR-128-3p水平升高,Nrf2 mRNA及蛋白水平降低,大鼠腦皮質(zhì)病理損傷加重,神經(jīng)功能缺損評分及血清中S100β、NSE、IL-6、TNF-α水平顯著增高,表明針刺對miR-128-3p表達的下調(diào)作用及對缺血再灌注大鼠腦損傷的保護作用可被miR-128-3p激動劑逆轉(zhuǎn),進一步提示針刺可能通過下調(diào) miR-128-3p表達改善缺血性卒中大鼠神經(jīng)功能。

綜上所述,針刺可能通過下調(diào) miR-128-3p表達,促進 Nrf2表達,抑制炎癥反應,從而減輕缺血性卒中大鼠腦損傷,改善其神經(jīng)功能,為采用針刺療法改善缺血性卒中患者神經(jīng)功能提供一定參考依據(jù)。但本文只對其進行了初步探討,關(guān)于針刺對Nrf2信號通路下游分子的調(diào)控作用及miR-128-3p是否可靶向調(diào)節(jié)Nrf2表達均未涉及,將在后續(xù)進行更深入研究,以進一步闡釋針刺治療卒中的具體機制。