EDTA對黏菌素體外抗菌活性的影響

劉小康,李帥華,張夢珂,潘玉善,劉建華,苑 麗,胡功政

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院,河南 鄭州 450000)

黏菌素(Colistin)是一種陽離子多肽類抗生素,又名多黏菌素E,是人醫(yī)臨床、獸醫(yī)臨床上常用的抗菌藥物。黏菌素因其腎毒性作用大,在20世紀(jì)80年代早期曾被世界大多數(shù)地區(qū)棄用。然而多重耐藥菌的出現(xiàn)以及對革蘭氏陰性微生物有活性的新抗菌藥物的缺乏,黏菌素作為治療革蘭氏陰性菌感染的最后一道防線,被重新應(yīng)用于治療多重耐藥的陰性菌感染[1]。黏菌素的抗菌機(jī)理是通過分子中的聚陽離子環(huán)與細(xì)菌細(xì)胞外膜上類脂A作用,置換外膜中的鈣和鎂等陽離子,破壞陰性菌帶負(fù)電荷的外膜而降低細(xì)胞膜的穩(wěn)定性,使細(xì)胞內(nèi)重要物質(zhì)外流從而產(chǎn)生殺菌作用[2]。然而自2015年由質(zhì)粒介導(dǎo)的黏菌素耐藥基因mcr-1首次被報道以來,又相繼在中國或其他國家分離的腸桿菌科細(xì)菌中檢測出了mcr-2～mcr-10等9種新的mcr基因亞型[3-6]。mcr基因隨著可移動質(zhì)粒在不同物種不同菌屬之間的水平傳播,顯著加快了黏菌素抗性的傳播速度,給畜牧業(yè)及人類健康帶來了嚴(yán)重威脅。

除了上述重要的耐藥機(jī)制外,外排泵和外膜的屏障作用是引起黏菌素抗性的非特異性因素[3],故尋求有效的外排泵抑制劑或膜通透性促進(jìn)劑,是增強(qiáng)黏菌素抗菌活性或增強(qiáng)細(xì)菌黏菌素敏感性的有效策略。外排泵抑制劑如氰氯苯腙(CCCP)、2,4—二硝基酚(DNP)和利血平等由于自身的毒性作用,限制了其在臨床上的應(yīng)用[7]。EDTA作為二價陽離子的螯合劑,被證實(shí)可通過競爭性結(jié)合與外膜脂多糖靜電相連的Ca2+和Mg2+,使外膜的穩(wěn)定性減弱,并在介質(zhì)中釋放脂多糖,最終增加革蘭氏陰性菌的外膜通透性[8]。據(jù)Banin E等[9]報道，與EDTA聯(lián)用時慶大霉素對銅綠假單胞菌的殺滅效果可達(dá)1000倍以上。盡管EDTA作為膜通透性促進(jìn)劑,已被證實(shí)增強(qiáng)了多種抗菌藥物的活性[10,11],但關(guān)于EDTA對腸桿菌科細(xì)菌的黏菌素敏感性的影響尚未見研究報道。本研究選定從豬和雞中分離的沙門菌、大腸桿菌,從表型上觀察了膜通透性促進(jìn)劑 EDTA對黏菌素作用的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 51株沙門菌和34株大腸桿菌,以及臨床分離的黏菌素天然耐藥菌奇異變形桿菌3株和摩氏摩根菌1株(對照菌),均是由本實(shí)驗(yàn)室保存的經(jīng)過鑒定的臨床分離菌株。鼠傷寒沙門菌標(biāo)準(zhǔn)株CVCC?541(命名為JS),購自中國獸藥監(jiān)察所;質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC?25922,購自中國普通微生物菌種保存中心。

1.1.2 藥品儲備液的制備 黏菌素(效價為23988 U/mg,購于河北圣雪大成唐山制藥有限責(zé)任公司):用無菌去離子水配成5120 mg/L的儲備液。乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na):用無菌去離子水配成5000 mg/L的儲備液。以上儲備液均要過濾除菌,置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3主要試劑及培養(yǎng)基 瓊脂糖(Takara,Japan)、2×Taq Master Mix酶、DM2000 DNA Marker (Takara, Japan)、TE緩沖液和熒光染料溴化乙錠EB均購于上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司; LB肉湯、LB瓊脂、MHB肉湯、麥康凱瓊脂和SS瓊脂,均購于青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌的復(fù)蘇 將保存在-80 ℃的甘油菌取出,融化后上下顛倒搖勻,吸取100 μL接種于4 mL新鮮LB肉湯培養(yǎng)基,于37 ℃培養(yǎng)過夜。用接種環(huán)蘸取適量，在麥康凱或SS瓊脂培養(yǎng)基上劃線,于37 ℃培養(yǎng)16～18 h,再挑取單菌落接種到4 mL LB肉湯中。將純化后的臨床菌置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2mcr基因的檢測 采用煮沸法提取基因組DNA,參考有關(guān)文獻(xiàn)報道的mcr基因引物[4-6,12-14],通過PCR擴(kuò)增和測序分析檢測質(zhì)粒介導(dǎo)的黏菌素抗性基因mcr-1～mcr-10。

1.2.3 EDTA對黏菌素MIC的影響 參照CLSI規(guī)定的操作方法[15],使用二倍微量肉湯稀釋法分別測定黏菌素和EDTA對受試菌株的最小抑菌濃度(MICs)。再測定亞抑菌濃度(sub-MIC)的EDTA存在時黏菌素對各菌株的MIC。以黏菌素天然耐藥菌奇異變形桿菌、摩氏摩根菌和沙門菌(標(biāo)準(zhǔn)菌株JS)為對照。以大腸桿菌ATCC?25922作為質(zhì)控菌株。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 體外殺菌曲線 選擇3株代表性沙門菌(標(biāo)準(zhǔn)菌株JS、臨床分離的雞源耐黏菌素沙門菌CS23和CS18),分別測定1/2MIC的黏菌素、sub-MIC的EDTA、1/2MIC的黏菌素+sub-MIC的EDTA的殺菌作用,分別在0、2、4、6、8、16和24 h取樣,涂板,置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h后計數(shù),測定活細(xì)胞數(shù),繪制體外殺菌曲線。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)分析 通過方差分析對EDTA作用前后黏菌素的MIC進(jìn)行差異顯著性評估,當(dāng)P值<0.05時被認(rèn)為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)粒介導(dǎo)的黏菌素耐藥基因

在85株臨床分離的沙門菌和大腸桿菌中,只檢測到mcr-1基因,擴(kuò)增片段長度為1626 bp,與預(yù)期大小相符(圖1)。其中沙門菌和大腸桿菌中的mcr-1陽性菌株分別有12株和11株(表1),檢出率總計為27.1%(23/85)。沒有檢測到mcr-2～mcr-10的陽性菌株。

M: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn);1～4:臨床分離株的PCR產(chǎn)物;N:陰性對照;P:陽性對照。圖1 部分mcr-1基因的凝膠電泳結(jié)果

2.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

黏菌素對沙門菌、大腸桿菌的MIC范圍見表1。根據(jù)CLSI規(guī)定的折點(diǎn),以黏菌素MIC≥4 mg/L標(biāo)準(zhǔn)判定為耐藥[15]。對照菌3株奇異變形桿菌和1株摩氏摩根菌對黏菌素天然耐藥(MIC>512 mg/L)。沙門菌的MIC最高達(dá)64 mg/L,其MIC50為1 mg/L,MIC90為32 mg/L。大腸桿菌的MIC范圍為0.5～32.0 mg/L,其MIC50、MIC90分別為0.5、8.0 mg/L.

表1 mcr-1檢出情況以及黏菌素對受試菌株的MIC值

表2展示了黏菌素及其與sub-MIC的EDTA聯(lián)用時,對臨床分離菌及對照菌株的抗菌活性。沙門菌和大腸桿菌對黏菌素的耐藥率分別為37.3%(19/51)、29.4%(10/34),耐藥率總計為34.1%(29/85)。EDTA對受試菌株的MIC范圍在125～500 mg/L,表明其體外抑菌作用十分微弱。黏菌素聯(lián)合EDTA后,對沙門菌和大腸桿菌的MIC不同程度地下降,但對奇異變形桿菌和摩氏摩根菌的MIC沒有變化。其中,60 mg/L的EDTA對沙門菌和大腸桿菌黏菌素耐藥率的影響有一定的差異,此濃度的EDTA使大腸桿菌的耐藥率從29.4%降低至2.9%,逆轉(zhuǎn)了9株大腸桿菌對黏菌素的抗性,但僅逆轉(zhuǎn)了5株沙門菌對黏菌素的抗性,使其耐藥率從37.3%降低至27.5%。方差分析結(jié)果顯示，在EDTA作用前后,黏菌素對分離菌的MIC存在顯著差異(P<0.001)。經(jīng)30 mg/L的EDTA作用后,統(tǒng)計結(jié)果顯示P值為0.00439,說明此EDTA濃度對黏菌素的抑菌活性仍有一定的增強(qiáng)作用。15 mg/L EDTA對大部分菌株的MIC基本上不產(chǎn)生影響。聯(lián)合EDTA后，黏菌素對沙門菌標(biāo)準(zhǔn)株JS的MIC降低了2～4倍。由此可見,EDTA對黏菌素的MIC的影響呈濃度依賴性,≥30 mg/L的EDTA可增強(qiáng)除天然黏菌素耐藥菌株之外的臨床分離菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株對黏菌素的敏感性。

表2 黏菌素單用及與不同濃度的EDTA聯(lián)用對臨床分離株和標(biāo)準(zhǔn)株的抗菌活性

2.3 體外殺菌曲線結(jié)果

對標(biāo)準(zhǔn)株JS(MIC=1 mg/L)、耐黏菌素的mcr-1陽性菌株CS23(MIC=32 mg/L)和mcr-1陰性菌株CS18(MIC=32 mg/L),分別測定黏菌素(1/2MIC)、EDTA(sub-MIC)及兩藥聯(lián)合的殺菌作用。結(jié)果見圖2。在黏菌素單獨(dú)作用的前4 h內(nèi),3株菌的活菌數(shù)均不同程度地下降,然后開始上升,第8 h后生長速度變慢,最后逐漸趨于平穩(wěn)。單獨(dú)使用EDTA基本上沒有抑菌作用,供試菌株的生長趨勢與只有細(xì)菌的對照組的生長趨勢基本一致。當(dāng)黏菌素存在時,EDTA的加入顯著影響了細(xì)菌的生長,對于JS和CS18,如圖2a和圖2b所示,在第2 h附近,活菌數(shù)處于最低水平,但之后均開始增加,其中JS在第4 h恢復(fù)至單獨(dú)黏菌素作用的水平,而CS18則直至第24 h才恢復(fù)至單獨(dú)黏菌素作用的水平。對于CS23,如圖2c所示,黏菌素聯(lián)合EDTA后,活菌數(shù)始終低于單獨(dú)黏菌素作用組,在第8 h后,呈現(xiàn)下降趨勢,且在第8、16 h,活菌數(shù)分別比單獨(dú)黏菌素組降低了2和4 log cfu/mL,說明EDTA顯著增強(qiáng)了黏菌素對此菌株的殺菌作用。

圖2 黏菌素、EDTA及兩者聯(lián)用對菌株JS、CS18和CS23的體外殺菌曲線

3 討論與結(jié)論

近年來,因用于治療革蘭氏陰性菌感染的碳青霉烯類、頭孢菌素類和氟喹諾酮類等抗菌藥物的耐藥性普遍提高,黏菌素作為治療革蘭氏陰性菌感染的最后手段被廣泛應(yīng)用,這使得耐黏菌素的細(xì)菌菌株不斷被檢出[16]。本研究報道的85株臨床分離的沙門菌和大腸桿菌中,對黏菌素的耐藥率分別為37.3%(19/51)、29.4%(10/34),mcr-1的陽性率為27.1%(23/85),未檢出mcr-2～mcr-10基因。在23株mcr-1陽性菌株中,有3株對黏菌素不耐藥,說明mcr-1可能在這些菌株中沒有表達(dá)或低表達(dá)。除此之外,仍有9株mcr-1陰性菌株對黏菌素耐藥,說明除了質(zhì)粒介導(dǎo)的mcr-1外,其他機(jī)制如染色體介導(dǎo)的或非特異性耐藥機(jī)制也發(fā)揮著重要作用。在質(zhì)粒介導(dǎo)的mcr基因被報道以前,染色體介導(dǎo)的雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)被認(rèn)為是介導(dǎo)黏菌素耐藥的主要機(jī)制,這一機(jī)制是由相關(guān)基因如pmrAB、phoPQ、mgrB和pmrD等發(fā)生突變或表達(dá)量變化而引起外膜類脂A的糖化(Ara4N化)或乙醇胺化(pETN化)修飾,繼而使LPS的負(fù)電荷減少,最終導(dǎo)致陽離子黏菌素與細(xì)菌外膜陰性LPS的親和力降低,使細(xì)菌耐藥[17]。

本研究的聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明,對于黏菌素天然耐藥菌奇異變形桿菌和摩氏摩根菌,聯(lián)用sub-MIC的EDTA對黏菌素的MIC不產(chǎn)生影響,這可能與菌株天然耐藥的不同機(jī)制有關(guān)。但有效的EDTA濃度可使黏菌素對大腸桿菌和沙門菌的MIC降低,導(dǎo)致菌株的耐藥率下降,且無論對于質(zhì)粒介導(dǎo)的黏菌素抗性菌株還是由其他機(jī)制介導(dǎo)的黏菌素抗性菌株,EDTA均可增強(qiáng)其對黏菌素的敏感性,這可能是因?yàn)镋DTA螯合Ca2+與Mg2+引起的外膜解離和滲透作用增強(qiáng)了藥物的抗菌效力[8],其具體分子機(jī)制有待研究。本試驗(yàn)結(jié)果表明:EDTA濃度越高，其增效作用越強(qiáng),其增強(qiáng)黏菌素抑菌活性的作用呈現(xiàn)濃度依賴性。體外殺菌曲線表明:黏菌素聯(lián)合EDTA后,細(xì)菌的生長受到明顯抑制,雖然抑制程度在不同菌株之間存在一定差異,但仍能清楚地證實(shí)EDTA可增強(qiáng)黏菌素對分離菌株的抗菌活性,且對mcr-1陽性和mcr-1陰性菌株的作用相同,表明其作用不受不同獲得性耐藥機(jī)制的影響。統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示:60 mg/L或30 mg/L的EDTA作用前后,黏菌素對受試菌株的MIC差異顯著。說明≥30 mg/L的EDTA可有效增強(qiáng)黏菌素的抗菌活性。EDTA對黏菌素抗菌活性的增強(qiáng)也表明:外膜屏障作用介導(dǎo)的非特異性耐黏菌素機(jī)制可能占據(jù)著不可或缺的地位,與質(zhì)粒介導(dǎo)的mcr-1或染色體介導(dǎo)的雙組分系統(tǒng)共同導(dǎo)致了菌株對黏菌素的高水平耐藥。

隨著多重耐藥菌株的不斷增加,單一抗菌藥的療法也面臨著巨大挑戰(zhàn),因此使用抗菌藥與抗菌增效劑結(jié)合的療法可在一定程度上緩解日益嚴(yán)重的耐藥問題,從而進(jìn)一步增強(qiáng)抗菌藥物的療效。本研究從表型上證實(shí)了EDTA可增強(qiáng)不同耐藥機(jī)制的沙門菌和大腸桿菌對黏菌素的敏感性,為臨床上潛在藥物如EDTA的應(yīng)用提供了重要參考,但還需要進(jìn)一步的研究來探索EDTA在體內(nèi)的劑量和安全性。