溴代鯨蠟基吡啶-剛果紅共振光散射測定畜禽肉中殘留拉米夫定

何樹華,龐向東,張又丹,江虹

(長江師范學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，重慶， 408100)

畜禽養(yǎng)殖業(yè)中，越來越多的養(yǎng)殖戶把抗病毒藥物用于預(yù)防和治療畜禽病毒感染。中華人民共和國農(nóng)業(yè)部早在2005年10 月針對抗病毒藥物發(fā)布了“第 560 號”公告，明確指出，“金剛烷胺類等人用抗病毒藥移植獸用，缺乏科學(xué)規(guī)范、安全有效實驗數(shù)據(jù)，用于動物病毒性疫病不但給動物疫病控制帶來不良后果，而且影響國家動物疫病防控政策的實施”。但近年仍有些不法商販，為了高利潤和高回報，在經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使下，將某些人用的具有較好療效的抗病毒藥物(如利巴韋林、拉米夫定、阿昔洛韋等)非法用在畜禽動物上，由此產(chǎn)生的藥物殘留不僅影響畜禽產(chǎn)品質(zhì)量，而且對人們的健康帶來危害。對于動物源性食品中殘留抗病毒藥物，我國目前尚無法定檢測方法。

拉米夫定檢測方法主要有液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[1-8]和高效液相色譜法[9-15]，偶見分光光度法[16-17]和電化學(xué)法[18]。前兩種方法雖有高的準(zhǔn)確度，但存在前處理操作繁瑣、重現(xiàn)性較差，且運行和維護(hù)費用高等不足；分光光度法雖簡便，但靈敏度較低；電化學(xué)法因需特殊電極材料，條件較為苛刻；共振光散射法是新近發(fā)展起來的一種用于微量和痕量檢測的高靈敏分析技術(shù)，盡管在藥物分析領(lǐng)域應(yīng)用較多[19]，但未見用于畜禽肉食中拉米夫定的藥殘分析。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，在弱堿性溶液中，用溴代鯨蠟基吡啶增敏剛果紅后，與拉米夫定以靜電引力結(jié)合生成的離子締合物的共振光散射(resonance light scattering,RLS)增強(qiáng)強(qiáng)度(ΔIRLS)與拉米夫定濃度間有一定的線性關(guān)系，本研究將其用于畜禽肉中的藥物殘留分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

拉米夫定(lami udine)對照品：99.7%～99.9%，批號 101007-201502，中國食品藥品檢定研究院；剛果紅(congo red)：99%，上海寶曼生物科技有限公司；氨丁三醇(TRIS)：99%，河南天孚化工有限公司；鹽酸：分析純，重慶華東化工有限公司；溴代鯨蠟基吡啶(cetylpyridinium bromide)：99%，武漢易泰科技有限公司上海分公司；水：超純水(自制，成都優(yōu)普超純水儀)。

豬肉(1#～3#)、雞肉(4#)：購自當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場。

1.2 儀器與設(shè)備

熒光分光光度計(F-2500 型)，日本日立公司(設(shè)λex=λem=220 nm，測定狹縫5.0 nm)；超聲波清洗機(jī)(KQ-200 DE 型)，昆山市超聲儀器有限公司；精密酸度計(pHS-3C型)，上海理達(dá)儀器廠。

1.3 溶液的配制

拉米夫定標(biāo)準(zhǔn)溶液：精密稱取拉米夫定對照品適量(準(zhǔn)至±0.100 0 mg)，加適量水溶解完全后轉(zhuǎn)移至100 mL 容量瓶中，定容，配成229.3 mg/L 貯備液，操作液為2.293 mg/L，存于4 ℃冰箱中。剛果紅溶液：0.100 mmol/L 水溶液。溴代鯨蠟基吡啶溶液：500 mg/L水溶液。TRIS 溶液：200 mmol/L水溶液。鹽酸溶液：100 mmol/L水溶液。TRIS-鹽酸溶液：pH 3.2～9.5(用酸度計測定鹽酸溶液與TRIS溶液混合液的pH 值)。

1.4 樣品處理

取生鮮豬肉(1#、2#和3#)及現(xiàn)殺雞肉(4#)，去皮、洗凈、攪成肉末。準(zhǔn)確稱取各肉末樣20 g 左右(精確至±0.100 0 mg)分別置于燒杯中，加適量水，于40 ℃熱水浴中超聲提取30 min，取出，離心分離(4 000 r/min)，將離心液置于另一燒杯中，剩余部分重復(fù)提取1次，將2次上清液合并，加入20 mL 甲醇，在80 ℃恒溫水浴中提取30 min(拉米夫定在熱溶液中穩(wěn)定[20]，而蛋白質(zhì)變性沉淀)，離心分離，清液于通風(fēng)櫥內(nèi)100 ℃水浴濃縮至適量，冷卻后轉(zhuǎn)至10.0 mL 比色管中，用水定容備用。

1.5 實驗方法

精密移取拉米夫定標(biāo)準(zhǔn)操作液0～1.20 mL 于10 mL 比色管中，加入0.100 mmol/L 剛果紅溶液2.50 mL，pH 7.63 TRIS-鹽酸溶液2.00 mL，搖勻，再加入500 mg/L溴代鯨蠟基吡啶溶液0.50 mL，搖勻后用水定容至10 mL。不斷搖動，待充分反應(yīng)10 min 后，在熒光儀上掃描共振光散射(RLS)光譜，測定398 nm 處的RLS 強(qiáng)度(IRLS)及試劑空白的RLS 強(qiáng)度(I0)，求出溶液的共振光散射增強(qiáng)強(qiáng)度ΔIRLS(=IRLS-I0)。

2 結(jié)果與討論

2.1 TRIS-鹽酸溶液的反應(yīng)條件

2.1.1 溶液的pH 及用量

當(dāng)體系溶液中所取拉米夫定標(biāo)準(zhǔn)操作液為1.00 mL、剛果紅溶液及溴代鯨蠟基吡啶溶液分別為2.00 mL和0.10 mL 時，考察了398 nm 處，pH 3.2～9.5 范圍內(nèi)不同pH下的TRIS-鹽酸溶液對體系反應(yīng)靈敏度(即ΔIRLS的大小)的影響。從圖1-a可知，體系反應(yīng)的適宜pH在 7.2～8.2，超出該范圍，ΔIRLS值均有下降(原因：當(dāng)pH<7.2，尤其溶液處于酸性范圍時，反應(yīng)不能完全；當(dāng)pH>8.2，溶液的堿性逐漸增強(qiáng)時，反應(yīng)也不能完全)。故實驗選用pH 7.63 的TRIS-鹽酸溶液。從圖1-b可知，pH 7.63 溶液的最佳用量為2.00 mL。故后續(xù)選定TRIS-鹽酸溶液的pH為7.63，用量為2.00 mL。

圖1 TRIS-鹽酸溶液的pH 及用量對ΔIRLS的影響Fig.1 Effect of the pH and dosage of TRIS-HCl solution on the ΔIRLS

2.1.2 剛果紅溶液濃度

當(dāng)體系溶液中所取拉米夫定標(biāo)準(zhǔn)操作液和溴代鯨蠟基吡啶溶液與2.1.1 項相同，所取TRIS-鹽酸溶液為選定的最佳條件(即2.00 mL,pH 7.63)時，考察了398 nm 處，0.50～3.00 mL 范圍內(nèi)的剛果紅溶液對體系反應(yīng)靈敏度(即ΔIRLS的大小)的影響。從圖2 可知，0.100 mmol/L 剛果紅溶液的最佳用量為2.50 mL，大于或小于該值，反應(yīng)的ΔIRLS均有下降(原因：當(dāng)剛果紅溶液取量小于2.50 mL 時，因用量不足，反應(yīng)不能達(dá)到完全；當(dāng)剛果紅溶液取量大于2.50 mL 時，因該液過量，剛果紅自身的聚集也會使反應(yīng)不完全)。故后續(xù)實驗選擇剛果紅濃度為0.100 mmol/L，用量為2.50 mL。

圖2 剛果紅用量對ΔIRLS的影響Fig.2 Effect of congo red dosage on the ΔIRLS

2.1.3 溴代鯨蠟基吡啶溶液用量

當(dāng)體系溶液中所取拉米夫定標(biāo)準(zhǔn)操作液為1.00 mL，所取剛果紅溶液和TRIS-鹽酸溶液為上述選定的最佳條件時，考察了398 nm 處，0.10～0.70 mL 范圍內(nèi)的500 mg/L溴代鯨蠟基吡啶溶液對體系反應(yīng)靈敏度(即ΔIRLS的大小)的影響。從圖3 可知，溴代鯨蠟基吡啶溶液的最佳用量為0.50 mL，大于或小于該值，靈敏度均不能達(dá)最高。故后續(xù)實驗選用的溴代鯨蠟基吡啶的用量為0.50 mL。

圖3 溴代鯨蠟基吡啶用量對ΔIRLS的影響Fig.3 Effect of 1-hexadecylpyridinium bromide dosage on the ΔIRLS

2.1.4 試劑加入順序

在拉米夫定標(biāo)準(zhǔn)操作液及前述選定的TRIS-鹽酸、剛果紅及溴代鯨蠟基吡啶溶液的條件固定不變時，考察這幾種物質(zhì)在加入順序不同時，對反應(yīng)靈敏度(即ΔIRLS的大小)的影響。結(jié)果顯示，體系反應(yīng)最完全、靈敏度相對最高的加入順序為：拉米夫定、TRIS-鹽酸、剛果紅、溴代鯨蠟基吡啶(ΔIRLS=165)。

2.1.5 反應(yīng)時間

在物質(zhì)的最佳加入順序及最佳反應(yīng)條件下，考察不同反應(yīng)時間對反應(yīng)靈敏度(即ΔIRLS的大小)的影響。結(jié)果表明，拉米夫定、剛果紅及溴代鯨蠟基吡啶在弱堿性溶液中，10 min 內(nèi)即可反應(yīng)完全(從反應(yīng)開始至10 min 內(nèi)，ΔIRLS隨反應(yīng)時間的增加逐漸增大)，反應(yīng)達(dá)10 min 時，ΔIRLS達(dá)最大；10～70 min內(nèi)，ΔIRLS基本穩(wěn)定；70 min 后，ΔIRLS有降低趨勢。故實驗選在反應(yīng)10 min 后的穩(wěn)定區(qū)進(jìn)行。

2.2 共振光散射光譜特征

拉米夫定、剛果紅及溴代鯨蠟基吡啶的共振光散射光譜見圖4。拉米夫定因分子結(jié)構(gòu)上氨氮的孤對電子可接受質(zhì)子，使其在溶液中以陽離子形式存在；剛果紅是一種雙偶氮的酸性染料，分子結(jié)構(gòu)上含有2 個磺酸根，使其在溶液中以陰離子形式存在；溴代鯨蠟基吡啶是一種陽離子表面活性劑，在溶液中以陽離子形式存在。當(dāng)拉米夫定與剛果紅在弱堿性溶液中混合時，從結(jié)構(gòu)式可知，他們可以以靜電結(jié)合生成離子締合物，但從圖4的光譜曲線6 可知，該締合物的共振光散射信號較弱(拉米夫定和剛果紅自身的RLS 信號很弱，見曲線1 和曲線2)，不宜進(jìn)行拉米夫定的定量分析。從曲線3、4、5可知，溴代鯨蠟基吡啶或其在弱堿性溶液中的RLS 信號很弱，剛果紅的弱堿性溶液的RLS 信號也很弱，但如果將剛果紅的弱堿性溶液與溴代鯨蠟基吡啶混合后，其RLS 信號將明顯增強(qiáng)(曲線7)，這種現(xiàn)象說明陽離子表面活性劑溴代鯨蠟基吡啶可以增敏剛果紅，并產(chǎn)生新的RLS 光譜，他的特征最大RLS 峰位于398 nm，在450～520 nm 范圍內(nèi)有多個較小的RLS 峰。從曲線7～13 可知，當(dāng)在曲線7 的溶液中加入不同質(zhì)量濃度的拉米夫定后，其RLS 信號隨著拉米夫定濃度的增大而增強(qiáng)，但只有在最大峰398 nm 處，其RLS 信號與拉米夫定的質(zhì)量濃度有線性關(guān)系，因此選擇398 nm 作為測定波長，用于定量檢測拉米夫定。

從譜線和物質(zhì)結(jié)構(gòu)可知，他們的可能反應(yīng)機(jī)理及RLS 增強(qiáng)原因為：在實驗條件下，帶正電荷的溴代鯨蠟基吡啶以預(yù)膠束聚集態(tài)與以陰離子形式存在的剛果紅分子通過靜電作用生成分子體積更大的復(fù)雜聚集體，從而使共振光散射明顯增強(qiáng)；當(dāng)有拉米夫定存在時，由于分子結(jié)構(gòu)上氨氮孤對電子可接受質(zhì)子，于是與帶負(fù)電荷的締合顆粒(剛果紅-溴代鯨蠟基吡啶)進(jìn)一步以靜電作用生成電中性的三元締合物，新聚集體的摩爾質(zhì)量和體積變得更大，從而使共振光散射增強(qiáng)。

1-拉米夫定(0.229 mg/L); 2-剛果紅(0.025 0 mmol/L); 3-溴代鯨蠟基吡啶(25.0 mg/L); 4-剛果紅(0.025 0 mmol/L), pH 7.63; 5-溴代鯨蠟基吡啶(25.0 mg/L), pH 7.63; 6-拉米夫定(0.229 mg/L)-剛果紅(0.025 0 mmol/L), pH 7.63; 7～13-拉米夫定(0.00、0.045 9、0.091 7、0.138、0.183、0.229、0.275 mg/L)-剛果紅(0.025 0 mmol/L)-溴代鯨蠟基吡啶(25.0 mg/L), pH 7.63圖4 拉米夫定-剛果紅-溴代鯨蠟基吡啶的共振光散射光譜Fig.4 Resonance light scattering spectra of lami udine-congo red-cetylpyridinium bromide

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及靈敏度

精密移取2.293 mg/L 拉米夫定標(biāo)準(zhǔn)溶液0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20 mL于10 mL 比色管中，按最佳加入順序和反應(yīng)條件，加入剛果紅、TRIS-鹽酸及溴代鯨蠟基吡啶溶液，用水定容。按照1.5 小節(jié)的方法測定標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的ΔIRLS，做標(biāo)準(zhǔn)曲線。曲線的回歸方程為ΔIRLS=-2.320 4 + 696.96ρ，相關(guān)系數(shù)r=0.999 1，線性范圍為0.006～0.28 mg/L，檢出限為0.009 5 mg/kg，定量限為0.032 mg/kg。

2.3.2 選擇性

2.3.3 樣品測定、準(zhǔn)確度及精密度

取1.4 小節(jié)制得的待測樣液各3.00 mL(各平行5 份)，按試劑的最佳加入順序及反應(yīng)條件加入剛果紅、TRIS-鹽酸及溴代鯨蠟基吡啶溶液，用水定容至10 mL。按照1.5小節(jié)的方法測定ΔIRLS，再由回歸方程求得待測液中拉米夫定的含量，從而求得殘留于生鮮豬肉及雞肉中拉米夫定的含量，結(jié)果見表1。同時，用另一具有較高靈敏度的吸收光譜法(簡寫為 IS 法)進(jìn)行對照檢測。結(jié)果表明，2種方法測定結(jié)果相同(均未檢出殘留拉米夫定，見表1，即可將其含量看作0)，由統(tǒng)計學(xué)檢驗結(jié)果可知，F(xiàn)

為了進(jìn)一步判斷新方法的準(zhǔn)確度和精密度，對不同樣品作低、中、高3 種加標(biāo)水平(各水平做5 份平行試驗)的回收試驗(即準(zhǔn)確稱取空白肉末20 g 左右，加適量拉米夫定貯備液，再加適量二次水，后續(xù)處理同1.4小節(jié)，最終制得樣加標(biāo)待測液)。照1.5小節(jié)的方法，取樣加標(biāo)待測液，測定其拉米夫定總含量，再求出回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，即可判斷新方法的準(zhǔn)確度和精密度，結(jié)果見表1。

表1 畜禽肉樣的分析結(jié)果及回收試驗Table 1 Results and reco ery tests of li estock and poultry meat samples (n=5)

實驗表明，所購生鮮豬肉及雞肉中未檢測出殘留抗病毒藥物——拉米夫定，說明該畜禽產(chǎn)品質(zhì)量符合要求。

3 結(jié)論

以溴代鯨蠟基吡啶增敏剛果紅測定拉米夫定的共振光散射法除具有很高的靈敏度外，還有很好的選擇性、良好的線性關(guān)系及較寬的線性范圍，準(zhǔn)確度和精密度滿足痕量分析要求，樣品處理簡單、安全，成本低，適于生鮮豬肉及現(xiàn)殺雞肉中拉米夫定的藥殘分析。