海藻抗腫瘤活性肽的研究進(jìn)展

楊賢慶，劉晶，胡曉，陳勝軍，吳燕燕，李來好，戚勃，鄧建朝，楊莉莉

1(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，國家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州，510300) 2(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306) 3(廣東百維生物科技有限公司，廣東 化州，525100)

在腫瘤生物學(xué)、分子生物學(xué)、生物信息學(xué)等多學(xué)科的不斷發(fā)展與交叉融合的背景下，研究人員已經(jīng)在腫瘤的治療方面取得顯著成效。惡性腫瘤治療方法一般是依據(jù)患者的腫瘤階段分別采用手術(shù)、放射線、免疫和化學(xué)療法等[1]來進(jìn)行，但是這些治療手段對人體仍然會造成一定的毒副作用，尤其是對中晚期患者所采取的放化療法在將患者體內(nèi)的惡性腫瘤細(xì)胞殺死的同時(shí),對正常細(xì)胞也會有不可逆轉(zhuǎn)的損傷，另外還伴隨著人體不良反應(yīng)。長期使用也會讓癌細(xì)胞產(chǎn)生多重耐藥性，使藥物利用度降低[2]。據(jù)資料統(tǒng)計(jì)，估計(jì)2018年我國新增惡性腫瘤發(fā)病人數(shù)占據(jù)全球的1/5以上，死亡人數(shù)占據(jù)全球1/4以上[3]。惡性腫瘤已經(jīng)成為人類健康安全的嚴(yán)重威脅，也給社會經(jīng)濟(jì)造成不可估量的損失。天然來源的低毒甚至無毒、高利用率的治療腫瘤藥物或輔助食品已成為藥品行業(yè)和食品工業(yè)的研究熱點(diǎn)。

海藻源活性肽是存在于海藻體內(nèi)，經(jīng)由直接提取法(物理提取和化學(xué)試劑提取)、蛋白酶酶解法、微生物發(fā)酵法或者通過化學(xué)合成法獲取的介于蛋白質(zhì)和氨基酸之間的生物活性肽，具有維持人體健康的生理調(diào)節(jié)功能[4]。我國海域遼闊，海藻資源極其豐富，微藻和浮游海藻因其獨(dú)有的生活習(xí)性和生理結(jié)構(gòu)成為海藻活性肽中被關(guān)注頗多的種類[5],研究人員對大型藻類的研究也在逐漸深入。海藻中存在的活性肽具有抗腫瘤增殖、破壞微絲網(wǎng)絡(luò)、清除自由基等功能活性，對腫瘤細(xì)胞毒性較高但對正常細(xì)胞低毒(無毒)，表明海藻不僅豐富了生物活性肽的來源而且具有用于惡性腫瘤化療的潛力。本文依據(jù)近30年國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，按照結(jié)構(gòu)特征論述了海藻源活性肽的種類，并且重點(diǎn)總結(jié)海藻活性肽的基本制備方法、海藻抗腫瘤活性肽的活性評價(jià)方法及作用機(jī)制，以期為抗腫瘤藥物和食品開發(fā)提供幫助。

1 海藻活性肽的種類

海藻活性肽的分類多種多樣，以海藻的大小可以分為微藻活性肽和大型藻海活性肽；以海藻的種類可以分為紅藻活性肽、褐藻活性肽和綠藻活性肽；以活性肽的功能分類更廣，有海藻抗氧化肽、抗癌肽、抗菌肽等等。生物活性肽的氨基酸組成、序列、長度、總電荷以及疏水性等結(jié)構(gòu)特征均會對其活性產(chǎn)生影響[6]。本文按海藻活性肽的結(jié)構(gòu)特征將其分為環(huán)肽、脂肽和線性肽。

1.1 環(huán)肽

環(huán)肽(cyclic peptides)是海藻肽中最常見的一類肽，是指一類由α-氨基酸和一些不常見的非蛋白氨基酸以肽鍵形成的環(huán)狀天然小分子化合物[7]。藻類環(huán)肽通常比動物環(huán)肽要大，從軟體動物中獲得的環(huán)肽kahalalid A～E比同一家族的從羽藻中獲取的kahalalid F要小得多。kahalalid F的分子式為C75H126N14O17，氨基酸序列為[D-aoIle-Thr- al-Z-Dhb-L-Phe- al-D-aoIle-L-Orn-L-Pro- al- al-Thr- al-5-MeHex]，具有Thr-Ile-Orn-Pro- al- al-Thr- al和5-MB殘基形成的側(cè)鏈和Phe- al-Ile-Thr- al和DHAB的循環(huán)區(qū)的結(jié)構(gòu)，對前列腺癌和乳腺癌細(xì)胞株具有強(qiáng)烈的毒性作用(IC50的范圍從0.07～0.28 μmol/L)，而且KF細(xì)胞毒性與多藥耐藥MDR1和酪氨酸激酶HER2/NEU的表達(dá)水平無關(guān)，僅與抗凋亡BCL-2蛋白的表達(dá)水平有關(guān)[8]。從藍(lán)綠藻中發(fā)現(xiàn)具有溶細(xì)胞、細(xì)胞毒和神經(jīng)毒等活性作用的環(huán)肽hormothamnin A，氨基酸序列為[D-Phe-D-Leu-L-Ile-D-allo-Ile-L-Leu-Gly-D-Baoa-L-Hser-Dhha-L-HyPro-L-Hser][9]。從鞘絲藻中分離出的2種環(huán)肽wewakpeptin A和B，研究發(fā)現(xiàn)此肽對NCI-H460人肺腫瘤和神經(jīng)2A小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系細(xì)胞毒性較大(IC50約為0.4 μmol/L)[10]，其氨基酸序列分別為MeAla-Me al-Me al-Hi a-Pro-Pro- al-Dhoya-Ile的異構(gòu)體，結(jié)構(gòu)式見圖1。

1.2 脂肽

脂肽(lipopeptidic)是一類由親油的脂肪烴鏈和親水的肽鏈兩部分組成的具有兩親結(jié)構(gòu)的化合物，由于其特殊的化學(xué)組成和兩親結(jié)構(gòu)，使得脂肽具有抗菌活性外還具有多種特性[11]。從哈沙藻屬藍(lán)藻內(nèi)得到具有抗真菌活性的脂肽hassallidin A，分子式為C62H99N11O24，氨基酸組成包括D-Tyr，D-Thr，L-Thr，D-allo-Thr，N-MeThr，D-Glu，L-Glu，Gly和脫氫氨基丁酸 (Dhb)[9]。jamaicamides A～C是從海洋藍(lán)藻中分離出的3種具有抗腫瘤活性的高功能化脂肽，含有炔基溴化物、氯乙烯、甲氧基烯酮體系和吡咯烷酮環(huán)，分子式分別為C27H37N2O4ClBr、C27H37O4N2Cl、C27H39O4N2Cl。jamaicamides A～C對H-460人肺和神經(jīng)-2A小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株均表現(xiàn)出細(xì)胞毒性。這3種脂肽對兩個(gè)細(xì)胞系的IC50均約為15 μmol/L。而且這3種肽在5 μmol/L時(shí)都表現(xiàn)出鈉通道阻斷活性，對正常細(xì)胞產(chǎn)生的毒性效應(yīng)較小，僅僅只有蛤蚌毒素在0.15 μmol/L時(shí)反應(yīng)的一半[12]。從顫藻中新分離出2種均對HT-29和MDA-MB-435癌細(xì)胞株有抗增殖作用的環(huán)脂肽trichormamides C(IC50為1.7和1.0 μmol/L)和D(IC50為11.5和11.7 μmol/L)[13]，trichormamides C是一種環(huán)十一肽，trichormamides D是一種環(huán)十二肽，兩者均含有親脂β-氨基癸酸殘基，結(jié)構(gòu)式見圖2。

1.3 線性肽

線性肽(linear peptides)是指由氨基酸經(jīng)脫水縮合形成的線性結(jié)構(gòu)的化合物。一般來說環(huán)肽比線性肽穩(wěn)定性高，也具有更好的生物活性。從愛森藻中獲得具有抗病毒和抗過敏活性的愛森藻肽，結(jié)構(gòu)為L-吡咯啶酮-L-丙氨酸的線性肽[14]。另外從鹿角菜中提取出結(jié)構(gòu)為L-吡咯烷酮基-α-L-谷酰胺基-L-谷酰胺的鹿角菜肽[15]。LUKE等[16]對巨大鞘絲藻進(jìn)行分級提取發(fā)現(xiàn)線性肽desmethoxymajusculamide C (DMMC)，含有氨基酸Ala、N-Me al、N-MePhe、N-MeIle、Gly(2)以及殘基R-羥基酸2-羥基-3-甲基戊酸鹽(Hmpa)、β-氨基酸3-氨基-2-甲基戊酸鹽(Map)和4-氨基-2,2-二甲基-3-氧代戊酸(Dmop)，并且證實(shí)此肽使細(xì)胞微絲網(wǎng)絡(luò)破壞從而對HCT-116人結(jié)腸癌細(xì)胞系具有有效和選擇性的抗實(shí)體腫瘤活性(IC50=20 nmol/L)，結(jié)構(gòu)式見圖3。

a-愛森藻肽[14];b-鹿角菜肽[15];c-DMMC[16]圖3 海藻線性肽結(jié)構(gòu)式Fig.3 Structure of seaweed linear peptides

2 海藻活性肽的制備

生物活性肽以其優(yōu)越的生物功能特性贏得國內(nèi)外專家學(xué)者廣泛的研究。尋求高提取率同時(shí)不破壞活性肽活性的制備方法是進(jìn)行活性肽研究的重要方面。目前關(guān)于海藻活性肽制備的方法主要有以下4種：直接提取法，酶解法、微生物發(fā)酵法和人工合成法。海藻活性肽的制備流程見圖4。

圖4 海藻活性肽的制備流程Fig.4 Preparation process of seaweed acti e peptide

2.1 直接提取法

直接提取法包括物理提取和化學(xué)提取。物理提取是在綠色環(huán)保的背景下逐漸發(fā)展起來的處理方法，在不使用化學(xué)試劑的條件下，直接將細(xì)胞破壞提取出細(xì)胞內(nèi)的肽。低溫超高壓連續(xù)流法是物理提取的主要方法，該法可使藻細(xì)胞的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜全部裂解，獲取活性物質(zhì)并保持肽的生物活性。另外反復(fù)凍融法與超聲破壞結(jié)合也成為制備海藻活性肽的主要物理處理方法之一。

化學(xué)提取即使用化學(xué)試劑(強(qiáng)酸強(qiáng)堿、甲醇、乙醇、鹵代烴等)提取后經(jīng)分離純化直接得到海藻活性肽。大多數(shù)微藻均用此法提取。MARK等[17]采用乙醇提取后，肽混合物經(jīng)二氧化硅快速柱色譜洗脫，C18固相萃取柱和反相高效液相柱分離得到環(huán)肽kahalalid F。HAN等[10]用(CH2Cl2)∶(甲醇)(2∶1)反復(fù)提取鞘絲藻，得到的粗提液用硅膠真空液相色譜法分離，并且從10%己烷到100%甲醇的乙酸乙酯逐步增加溶劑梯度制備出環(huán)肽wewakamide A和guineamide G。除了以上直接將有機(jī)試劑作用在海藻原料上的方法外，還可作用在海藻原料提取或純化后的蛋白上，通過化學(xué)試劑破壞蛋白質(zhì)的肽鍵和空間結(jié)構(gòu)，得到小分子活性肽。

直接提取法一般用于實(shí)驗(yàn)室提取活性肽的實(shí)現(xiàn)，但是物理提取對設(shè)備的要求高和化學(xué)提取提取率較低，多種副產(chǎn)物生成，而且化學(xué)試劑的使用不當(dāng)也會改變產(chǎn)物結(jié)構(gòu)和活性。這些缺陷導(dǎo)致直接提取法難以適應(yīng)大規(guī)模的生產(chǎn)。

2.2 生物酶解

生物酶解是制備生物活性肽最快、最安全、最易控制的技術(shù)之一，它不僅可以提高蛋白質(zhì)的功能和生物學(xué)性質(zhì)，而且可以增加低商業(yè)價(jià)值的副產(chǎn)品的價(jià)值。此法利用蛋白酶的特異性催化蛋白質(zhì)中的肽鍵(酯鍵或酰胺鍵)水解為小分子肽活性物質(zhì)。這種特異性和水解條件(pH、溫度、時(shí)間，酶添加量)影響肽鏈的大小、氨基酸序列以及游離氨基酸的數(shù)量，從而影響水解產(chǎn)物的生物活性[18]。

不同的海藻種類具有不同的生物結(jié)構(gòu)，另外還有一些藻類需要特殊的保存方式，由此產(chǎn)生了不同的酶解方法[19]。小球藻類適合于采用單一酶或復(fù)合酶直接酶解；大型藻和單細(xì)胞藻等存在剛性細(xì)胞壁的藻類應(yīng)先將原料破碎后再進(jìn)行酶解；對于難以獲得和保存的藻類，應(yīng)先將海藻制成粉末或?qū)⑵鋬鋈诤笤倜附狻?/p>

生物酶解一般常用的有兩類酶，一是具有特定活性的蛋白酶，如胃蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和復(fù)合酶等。二是不同的非特定蛋白酶，如來源于灰鏈霉菌的鏈酶蛋白酶E和來源于米曲霉的黃曲酶，目前已被用于生產(chǎn)更穩(wěn)定和有效的生物活性肽，通過減少水解所需的反應(yīng)時(shí)間使其能夠獲得不同的特性，尤其是肽的組成和分子質(zhì)量分布。他們能夠有目的的剪切肽鏈來獲取所需要的生物活性肽，比較安全高效。除商業(yè)酶外，還有一些研究報(bào)道了利用粗酶水解蛋白質(zhì)[20]，這表明新的蛋白酶來源在生產(chǎn)海藻活性肽方面具有潛在的應(yīng)用前景。不同海藻肽的酶解條件及活性舉例見表1。

表1 不同海藻肽的酶解條件及活性舉例Table 1 Example of enzymatic hydrolysis conditions and acti ities of different seaweed peptides

2.3 微生物發(fā)酵法

發(fā)酵法是利用海藻自身的營養(yǎng)物質(zhì)培養(yǎng)微生物，同時(shí)微生物在生長代謝過程中會產(chǎn)生蛋白酶，這些復(fù)雜的蛋白酶系使海藻蛋白水解制備生物活性肽。利用微生物發(fā)酵法有眾多優(yōu)點(diǎn)，蛋白酶來源廣、繁殖快、微生物資源利用度高[21]，水解度高、修飾功能基團(tuán)、具備更優(yōu)良的生物活性且得到的生物活性肽分子質(zhì)量較小，發(fā)酵工藝簡單、生產(chǎn)成本低、更易于產(chǎn)業(yè)化，并且微生物本身也會產(chǎn)生一定營養(yǎng)作用。這些優(yōu)點(diǎn)使得微生物發(fā)酵法在食品和制藥工業(yè)具有廣泛的應(yīng)用前景。

發(fā)酵涉及多種代謝途徑，這些代謝途徑負(fù)責(zé)產(chǎn)生代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物對發(fā)酵產(chǎn)品的化學(xué)、生化和營養(yǎng)特性有重要貢獻(xiàn)。例如乳酸菌的蛋白水解系統(tǒng)由3個(gè)主要組成部分組成,與細(xì)胞壁結(jié)合的蛋白酶，促進(jìn)蛋白最初水解為寡肽，將寡肽轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)肽酶的特異性轉(zhuǎn)運(yùn)體，完成水解過程，將寡肽轉(zhuǎn)化為游離氨基酸和(或)低分子肽[22]。微生物產(chǎn)生蛋白水解酶的能力使它們能夠在發(fā)酵產(chǎn)品制造過程中釋放出活性肽。目前在海水魚，淡水魚、陸生植物中均有見微生物發(fā)酵法制備生物活性肽的報(bào)道，但是用此法制備海藻抗腫瘤活性肽的研究還比較少，僅見張明洞[23]采用枯草芽孢桿菌對螺旋藻發(fā)酵，制備出具有高活性的螺旋藻肽，當(dāng)含水量低于7%時(shí)，螺旋藻經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)生出的肽含量為15%～40%。

由于微生物發(fā)酵過程的復(fù)雜性，很多微生物的初級代謝產(chǎn)物或次級代謝產(chǎn)物均有毒或?qū)θ梭w有害，活性肽的安全問題和發(fā)酵制肽的作用機(jī)理也未得到完全解決。無法控制微生物代謝得到一些特殊功能的生物活性肽，此時(shí)需要根據(jù)生物活性肽的結(jié)構(gòu)選擇符合要求的特異性較高的酶。

2.4 化學(xué)合成法

化學(xué)合成法是一種高通量的制備方法，能夠在短時(shí)間內(nèi)合成大量的目標(biāo)肽以供篩選，包括固相合成法和液相合成法。使用固相合成法制備多肽之前首先需要知道目標(biāo)肽的氨基酸組成和排列方式。從C端(羧基端)向N端(氨基端)重復(fù)添加氨基酸的過程，通過連接劑與樹脂上的第一氨基酸連接，待合成后切割出完整目標(biāo)多肽。王竹君[30]采用固相合成法合成已知序列螺旋藻多肽，并證明了合成后多肽的抗腫瘤活性。由于目前分析純化技術(shù)的技術(shù)的不斷改進(jìn)和發(fā)展，高效液相色譜技術(shù)可根據(jù)目標(biāo)肽的性質(zhì)從復(fù)雜的混合肽產(chǎn)物中分離出純度較高的目標(biāo)肽，改善了固相合成分離出目標(biāo)肽雜質(zhì)較多的缺點(diǎn)，成為目前合成肽的主要方法。成芳[31]使用高效液相色譜合成法成功合成助抗癌活性天然產(chǎn)hapalosin。

但是化學(xué)合成法仍然存在副反應(yīng)多、肽活性低雜肽無法分離、毒性殘留等缺點(diǎn)，縮小了生物活性肽的制備范圍[21]。當(dāng)前基因組學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展為大量獲得某種特定活性的肽提供了另一種有效方法，即基因重組法。此法很大程度上提高了肽的產(chǎn)量和純度。但是基因重組技術(shù)對于具有營養(yǎng)價(jià)值的小分子肽難以合成，而且與化學(xué)合成法一樣，無法合成未知氨基酸序列的肽。

3 海藻抗腫瘤活性肽的活性評價(jià)

研究人員針對不同敏感性的海藻抗腫瘤活性肽使用不同的癌細(xì)胞株(系)進(jìn)行活性評價(jià)，這些細(xì)胞系由于不同的來源具有不同的形態(tài)和特征。常用的癌細(xì)胞株[32]包括人肝癌細(xì)胞HepG2、BEL-7402、SMMC-7721；人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、MDA-MB-435、SKBR-3、BT474；人胃癌細(xì)胞株SGC-7901，AGS；人肺癌細(xì)胞H-460、A549、NCI-H460、H4160；人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29、Caco-2、HCT-116、C2BBel；宮頸癌細(xì)胞Hela；人卵巢癌耐長春花堿細(xì)胞(SK LB1)；人前列腺癌細(xì)胞株DU145；鼠白血病細(xì)胞株L-1210；小鼠白細(xì)胞P388；小鼠BALB/C巨噬細(xì)胞RAW 264.7細(xì)胞；小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株神經(jīng)-2A等。

3.1 體外評價(jià)方法

對癌細(xì)胞株經(jīng)不同濃度及培養(yǎng)時(shí)間處理后進(jìn)行抗腫瘤活性的體外評價(jià)，通常使用MTT法和流式細(xì)胞術(shù)法。

3.1.1 MTT法

MTT法是基于活細(xì)胞線粒體脫氫酶活性的檢測，采用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化銨(MTT)體外微孔板法，對海藻抗腫瘤活性肽的抗增殖和細(xì)胞毒性作用進(jìn)行評價(jià)[5]。MTT可被活細(xì)胞線粒體脫氫酶還原為藍(lán)紫色甲瓚產(chǎn)物，以IC50為指標(biāo)反映細(xì)胞存活率評價(jià)海藻抗腫瘤活性肽的抗增殖和細(xì)胞毒性作用。

3.1.2 流式細(xì)胞術(shù)法

由于細(xì)胞凋亡是DNA損傷不可修復(fù)時(shí)細(xì)胞死亡的主要類型，在最終決定癌細(xì)胞命運(yùn)中起著關(guān)鍵作用，所以除了評價(jià)海藻抗腫瘤肽的抗增殖和細(xì)胞毒性作用外，研究人員還對細(xì)胞凋亡、壞死和細(xì)胞紊亂周期進(jìn)程進(jìn)行探究，以期闡明海藻抗腫瘤肽的機(jī)制[33]。細(xì)胞周期分析通常是用流式細(xì)胞術(shù)來區(qū)分細(xì)胞周期的不同階段(G1 s S s G2/M)。流式細(xì)胞術(shù)包括PI單染法和Annexin -FITC/PI雙染法。細(xì)胞被膜聯(lián)蛋白 和碘化丙啶(PI)通過質(zhì)膜完整性和通透性的差異來確定細(xì)胞是否存活、凋亡或壞死[5]。根據(jù)膜聯(lián)蛋白 檢測細(xì)胞膜外磷脂酰絲氨酸(PS)的暴露量來確定細(xì)胞凋亡的早期階段；PI染色晚期凋亡和壞死細(xì)胞的DNA，而不染色活細(xì)胞或早期凋亡細(xì)胞的完整質(zhì)膜這一特點(diǎn)來確定細(xì)胞凋亡的晚期階段。RIEGER[34]等人利用細(xì)胞固定過程中細(xì)胞通透性的變化，在染色程序后期1%甲醛固定步驟后引入RNase A，促進(jìn)染色后RNase A進(jìn)入細(xì)胞，從而改善了傳統(tǒng)流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)可能存在大量假陽性事件的缺陷。

3.1.3 激酶抑制實(shí)驗(yàn)

激酶抑制實(shí)驗(yàn)也是最廣泛的抗腫瘤活性肽篩選的評價(jià)方法。激酶作為人體中最豐富的酶之一，人體基因大概編碼518種不同的激酶，而且在真核細(xì)胞中占據(jù)重要的地位[36]。激酶在調(diào)節(jié)細(xì)胞活動和傳導(dǎo)細(xì)胞信號方面起著核心作用，另外在代謝、細(xì)胞生長、凋亡、免疫應(yīng)答、基因表達(dá)、腫瘤發(fā)生、細(xì)胞分化和增殖、代謝、DNA損傷修復(fù)等方面具有重要作用[37]。PKA抑制劑[38]已被發(fā)現(xiàn)在體外和體內(nèi)對多種人類腫瘤細(xì)胞株具有抗腫瘤活性，并能增強(qiáng)HI 感染患者的單核細(xì)胞功能。

3.1.4 其他體外評價(jià)方法

一些研究人員利用熒光顯微鏡和吖啶橙/溴化乙錠(AO/EB)染色法研究了海藻肽對細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的影響。細(xì)胞凋亡還具有一系列典型的形態(tài)學(xué)特征，如氣泡、收縮、染色質(zhì)濃縮、核碎裂和細(xì)胞分裂成膜結(jié)合的凋亡小體，可進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察[35]。凋亡相關(guān)蛋白Bax、p53、Caspase-3[33]、細(xì)胞色素c、Bcl-2的表達(dá)變化，抗凋亡蛋白(Bcl-2、caspase-9)和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白(cyclin A、cyclin E、cyclin-dependent kinase 2(cdk2)、p21和p27)也可用來闡明海藻抗癌活性，通常采用酶聯(lián)免疫分析。

3.2 體內(nèi)評價(jià)方法

除上述體外評價(jià)以外，還利用具有顯著陽性結(jié)果的動物模型對海藻抗腫瘤活性肽進(jìn)行體內(nèi)評價(jià)。體內(nèi)評價(jià)常以荷瘤小鼠為動物模型，小鼠通過皮下接種腫瘤細(xì)胞，建立腫瘤體內(nèi)評價(jià)模型[39]。接種24 h后，每天灌胃或注射海藻肽，根據(jù)癌細(xì)胞類型確定接種傳代時(shí)間、接種方式和位置。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死小鼠，切除腫瘤塊并取胸腺、脾臟、肝臟等器官，計(jì)算各器官指數(shù)，測量腫瘤大小、倍增時(shí)間和抑瘤率等。之后用印跡法制片，在顯微鏡下觀察。

4 海藻抗腫瘤活性肽的作用機(jī)制

海藻抗腫瘤活性肽的活性大小主要取決于其結(jié)構(gòu)特征，如氨基酸組成、序列、長度、總電荷/疏水性等。其中存在的氨基酸主要是纈氨酸、亮氨酸、脯氨酸、丙氨酸等疏水性氨基酸和一個(gè)或多個(gè)殘基賴氨酸。疏水性氨基酸對腫瘤細(xì)胞具有選擇性和較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，能增強(qiáng)抗腫瘤肽與腫瘤細(xì)胞膜雙層外葉的相互作用，所以含有較多疏水性氨基酸的低分子質(zhì)量多肽也具有較高的抗腫瘤活性；帶電(谷氨酸)和雜環(huán)氨基酸(脯氨酸)有助于多肽的抗腫瘤特性；肽中正電荷的強(qiáng)度和分子質(zhì)量的差異可能與細(xì)胞毒活性呈正相關(guān)。不同海藻來源的抗腫瘤活性肽舉例見表2。

4.1 直接抑制腫瘤細(xì)胞增殖

直接抑制腫瘤細(xì)胞增殖，干擾腫瘤細(xì)胞的表達(dá)。此為大多數(shù)海藻抗腫瘤肽的機(jī)制。王竹君等[30]通過對螺旋藻進(jìn)行酶解，得到9種抗腫瘤肽對肝癌和乳腺癌細(xì)胞均具有顯著的抑制增殖的活性作用。CHUAN等[29]對綠藻蛋白殘?jiān)崛〕龅碾腶lgae protein waste peptide (APWP)采用流式細(xì)胞術(shù)法發(fā)現(xiàn)此肽能誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GC死亡并且有明顯抑制AGC生長的作用，暴露在APWP下的24 h后，G1期的胃癌細(xì)胞減少，亞G1峰出現(xiàn)時(shí)間依賴性增加。肽組分在G1期后阻滯了細(xì)胞，亞G1期細(xì)胞的數(shù)量在肽組分給藥后24～48 h逐漸增加。

4.2 直接清除誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞變化的自由基

一些抗腫瘤肽是通過直接清除誘導(dǎo)DAN損傷和癌細(xì)胞變化的自由基作用的，這種抗腫瘤肽往往也同時(shí)具有一定的抗氧化活性[40]。曾巧輝以螺旋藻為原料制備出的多肽組分1、3和4號具有良好的抗氧化活性，同時(shí)對胃癌和結(jié)腸癌也有比較好的抑制效果。

4.3 促進(jìn)天然免疫應(yīng)答

通過刺激免疫系統(tǒng)，增加免疫系統(tǒng)的干預(yù)間接調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)展。在抗腫瘤過程中運(yùn)用人體本身的調(diào)節(jié)器官進(jìn)行干預(yù)，促進(jìn)天然免疫應(yīng)答。陳美珍等[41]建立H22荷瘤小鼠體外抗腫瘤模型，探討了龍須菜藻紅蛋白抗腫瘤作用與免疫作用之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)藻紅蛋白能夠促進(jìn)機(jī)體的細(xì)胞免疫活性和活化免疫細(xì)胞，這些免疫細(xì)胞同時(shí)對腫瘤細(xì)胞具有顯著殺傷作用。

4.4 破壞腫瘤細(xì)胞骨架及膜通透性

通過對腫瘤細(xì)胞骨架的破壞或改變腫瘤細(xì)胞膜的通透性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。LUKE等[16]證實(shí)鞘絲藻中制備出的環(huán)狀和線性肽具有抗腫瘤效果，進(jìn)行肌動蛋白微絲斷裂試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn),在52 nmol/L時(shí)這2種肽均導(dǎo)致了絲狀肌動蛋白完全喪失，由于在此濃度下的細(xì)胞形態(tài)的改變往往會伴隨著微絲網(wǎng)絡(luò)的完全破壞，從而證明此肽是通過細(xì)胞微絲網(wǎng)絡(luò)的破壞，對HCT-116人結(jié)腸癌細(xì)胞系的IC50=20 nmol/L顯示出有效和選擇性的抗實(shí)體腫瘤活性。

4.5 破壞腫瘤細(xì)胞細(xì)胞器

通過對腫瘤細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵細(xì)胞器的破壞誘導(dǎo)細(xì)胞壞死,SUAREZ等[8]發(fā)現(xiàn),從羽藻中制備的Kahalalide F(KF)對人前列腺癌和乳腺癌細(xì)胞有強(qiáng)烈的毒性作用，并且在此肽的作用下這2種癌細(xì)胞細(xì)胞結(jié)構(gòu)受到嚴(yán)重影響，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或溶酶體等關(guān)鍵細(xì)胞器的完整性受到嚴(yán)重?fù)p害。相比之下，核結(jié)構(gòu)得到了保留，染色質(zhì)和DNA降解沒有發(fā)生劇烈的變化。說明KF可能在一定程度上誘導(dǎo)線粒體自噬，從而導(dǎo)致壞死細(xì)胞死亡。

4.6 激活Caspase-3蛋白酶

海藻抗腫瘤肽激活Caspase-3蛋白酶也可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[42]。Caspase-3是Caspase家族蛋白酶中的一種腫瘤細(xì)胞凋亡的效應(yīng)者，由Caspase-3介導(dǎo)的特異性蛋白剪切是腫瘤細(xì)胞凋亡過程中的重要作用機(jī)制，通過激活Caspase-3酶使活化后的Caspase-3酶作用于底物上導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，并且產(chǎn)生細(xì)胞形態(tài)學(xué)上的改變：染色質(zhì)固縮，DNA片段化和細(xì)胞氣泡。

目前關(guān)于海藻抗腫瘤活性肽的作用機(jī)制還存在一定的缺陷，僅僅通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)在誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡和壞死的各種途徑方面進(jìn)行討論和探究，較少探討它們對腫瘤細(xì)胞生成機(jī)制的影響，例如腫瘤細(xì)胞DNA、RNA的合成和主要器官蛋白質(zhì)的合成。如果能夠在海藻抗腫瘤肽介導(dǎo)免疫和抗血管生成活性等方面做出更全面的研究，對今后的海藻抗腫瘤活性肽作用機(jī)制的系統(tǒng)化也會有更大價(jià)值。

5 總結(jié)與展望

海藻肽因有多種對人體健康有益處的生物功能活性而被眾多學(xué)者廣泛研究，其中抗腫瘤功能日益受到重視。我國作為海藻資源豐富的國家，充分利用海藻這一生物活性肽的來源也具有一定社會和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。目前研究已經(jīng)對海藻抗腫瘤活性肽的評價(jià)方法和作用機(jī)制進(jìn)行了廣泛的基礎(chǔ)性研究，但仍存在著一些局限性。(1)大型海藻抗腫瘤活性肽并未得到全面的研究，需要進(jìn)一步加深大型海藻肽抗腫瘤功能的研究，改善大型海藻肽的制備工藝，例如制備金屬螯合海藻活性肽等。確定海藻活性肽的氨基酸序列及分子結(jié)構(gòu)，提高其抗腫瘤活性。(2)海藻抗腫瘤活性肽雖有進(jìn)行活性作用機(jī)制的研究，但絕大多數(shù)局限于細(xì)胞水平，通常只是在體外顯示了對腫瘤細(xì)胞生長具有抑制作用，對于體內(nèi)模型的抗腫瘤活性并未有足夠的實(shí)驗(yàn)證明，缺乏安全性、毒理學(xué)評估、生物利用率的利用等。(3)關(guān)于海藻抗腫瘤活性肽的分子機(jī)制也十分有限，大多數(shù)研究集中在細(xì)胞凋亡和壞死的機(jī)制上，而還要加深許多其他方面需要研究才能完全闡明其作用方式與途徑，進(jìn)行膜受體、介導(dǎo)免疫和抗血管生成活性等探究。(4)大多數(shù)海藻抗腫瘤活性肽的研究中并未提及肽的保存問題，這對于化學(xué)性質(zhì)不太穩(wěn)定的肽十分不利。運(yùn)用當(dāng)前活性肽保存工藝和運(yùn)載工藝的發(fā)展，包括殼聚糖納米粒子的包裹和多囊脂質(zhì)體靶向運(yùn)載等方法，提高海藻抗腫瘤活性肽的穩(wěn)定性。未來還需提高海藻肽對腫瘤細(xì)胞的靶向治療能力，以期從天然海藻中獲得的肽盡可能被運(yùn)用到抗腫瘤藥品和食品工業(yè)當(dāng)中。